雙酚A對稀有鮈鯽氧化應(yīng)激及精巢組織細(xì)胞連接損傷的研究.pdf

1、雙酚A(bisphenol A，BPA)是一種廣泛存在的類雌激素內(nèi)分泌干擾物(EDCs)，它是在生產(chǎn)和生活中應(yīng)用最為廣泛的一類塑料制品。由于其大量的使用和不易降解的特性，對人類的生存環(huán)境和健康造成了威脅從而引起了人們的廣泛關(guān)注。
　　氧化應(yīng)激和免疫應(yīng)答是生態(tài)毒理學(xué)的重要研究內(nèi)容。研究表明BPA暴露后能夠誘導(dǎo)魚類產(chǎn)生氧化應(yīng)激和免疫應(yīng)答反應(yīng)，然而關(guān)于這兩者間的作用機制還不是很清楚。為了探究BPA暴露后魚體產(chǎn)生的氧化應(yīng)激和免疫應(yīng)答間的作

2、用機制，本研究中將稀有鮈鯽幼魚（3周齡）暴露于對照組和3個濃度（1、225和1000μg/L）的BPA組7天。利用了分光光度計法檢測了對照組和處理組中H2O2和NO的含量并用實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)的方法檢測了iNOS基因、TLRs通路相關(guān)基因以及細(xì)胞因子相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量。
　　近年來，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子可以影響雄性的生殖功能并可能損害精子發(fā)生過程，主要集中在

3、細(xì)胞因子對血睪屏障(blood-testis barrier，BTB)完整性的調(diào)控。在魚類中也存在著類似哺乳動物BTB的結(jié)構(gòu)，稱其為支持細(xì)胞(Sertoli cells，SCs)屏障。然而，關(guān)于BPA暴露后魚體內(nèi)細(xì)胞因子的改變?nèi)绾斡绊懢补δ艿姆肿訖C制的研究還比較少。為了探究BPA暴露后細(xì)胞因子的改變對稀有鮈鯽精巢的損傷作用，本研究將稀有鮈鯽雄魚（6月齡）暴露于15μg/L的BPA溶液7天、21天和35天后，通過組織切片和免疫組化方法分

4、析其性腺組織學(xué)和SCs屏障的完整性。同時，采用qRT-PCR和Western blotting的方法檢測了TNFα的mRNA水平和蛋白水平、SCs屏障相關(guān)蛋白(occludin和β-catenin)的mRNA和蛋白水平以及有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路基因p38MAPK的mRNA水平的表達(dá)。
　　本研究獲得的主要結(jié)果如下:
　　1、在1、225和1000μg/L BPA暴露7天后，發(fā)現(xiàn)幼魚中H2O2濃度在三個處理組中

5、均顯著上升，呈濃度依賴性。NO的含量在225μg/L BPA組中顯著升高而在1000μg/L的BPA組中顯著降低了，iNOS基因的表達(dá)量僅在225μg/L BPA處理組顯著升高。這個結(jié)果表明BPA暴露后誘導(dǎo)了稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。在225和1000μg/L BPA暴露組中IFNγ、CXCR3和CXCR5的mRNA表達(dá)均被顯著抑制，說明BPA暴露后可能產(chǎn)生了免疫抑制效應(yīng)并參與了T淋巴細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)。TLR4、MyD88、TRAF

6、6以及NF-κB的mRNA表達(dá)量在225和1000μg/L BPA組處理7天后均發(fā)生了顯著降低，并且此通路相關(guān)的下游信號分子TNFα、IL-1β以及IL-8基因表達(dá)在不同濃度BPA暴露下均受到了顯著抑制。這個結(jié)果表明在轉(zhuǎn)錄水平上TLRs信號通路可能參與了BPA誘導(dǎo)稀有鮈鯽幼魚體內(nèi)炎癥反應(yīng)的過程，并最終表現(xiàn)為免疫抑制的效應(yīng)。
　　2、15μg/L BPA暴露7天后雄魚精巢中出現(xiàn)了血管充血、炎癥細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象并檢測到TNFα的蛋白水平

7、顯著增加了。這表明BPA短期暴露時魚體對藥物較為敏感，可以快速引起魚體產(chǎn)生免疫應(yīng)答并改變細(xì)胞因子的表達(dá)。occludin和β-catenin蛋白是構(gòu)成SCs屏障的兩種重要蛋白。BPA暴露7天和21天后顯著降低了occludin和β-catenin的蛋白水平，并且免疫染色結(jié)果顯示BPA暴露7天精巢中occludin蛋白出現(xiàn)散亂分布現(xiàn)象。這個結(jié)果表明BPA暴露破壞了SCs屏障連接蛋白的完整性。此外，BPA暴露7天后檢測到SCs屏障的滲透性也

8、發(fā)生了改變，生物素滲透進入了成熟的精子細(xì)胞中，精巢中布滿了特異性染色。以上結(jié)果均說明BPA暴露后破壞了稀有鮈鯽精巢中SCs屏障的完整性。p38MAPK在細(xì)胞因子調(diào)節(jié)BTB功能的過程中具有重要作用。p38MAPK mRNA表達(dá)量在BPA暴露7天后顯著降低了，而暴露35天后顯著上升。這表明MAPK信號通路可能參與了BPA暴露后產(chǎn)生的TNFα對SCs屏障的損傷過程。
　　綜上所述，本研究通過檢測組織形態(tài)學(xué)、關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)和蛋白水