水體鎘暴露對稀有鮈鯽肝臟毒性及脂代謝影響的初步研究.pdf

1、鎘是世界上最毒的重金屬之一。由于工、農(nóng)業(yè)的發(fā)展等因素，自然環(huán)境，包括水生態(tài)受到嚴重的鎘污染。鎘在生物細胞內(nèi)不被降解，半衰期長，能在各組織累積，并造成極大的損傷。本研究以中國目前常用的環(huán)境毒理學(xué)研究實驗動物稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）性成熟雌魚為對象，運用組織學(xué)、組織化學(xué)、透射電鏡技術(shù)、生理學(xué)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等研究手段和方法，研究水體急、慢性鎘暴露對稀有鮈鯽肝臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)、肝細胞的細胞器、脂滴數(shù)量和沉積、有關(guān)代謝的

2、生理生化指標、脂滴形成相關(guān)基因的表達、有關(guān)脂代謝激素及信號通路影響；結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)，分析潛在的機制。其中第一部分實驗內(nèi)容研究了水體2.0 mg/L鎘暴露0-96 h，2.5、2.8 mg/L鎘暴露96 h以及0、5、25、50、75、100μg/L鎘暴露5w和12w對實驗魚肝臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)、細胞器的影響，以及肝組織脂滴沉積情況，以探討水體鎘暴露對稀有鮈鯽的生長和肝臟組織的損傷情況。第二部分實驗克隆了稀有鮈鯽自噬相關(guān)基因Beclin1的全長c

3、DNA序列，進行了生物信息學(xué)分析，檢測了該基因的時空表達模式，并研究了該基因在水體急、慢性鎘暴露后的各組織中的表達情況，以初步判斷鎘暴露與自噬的關(guān)系。第三部分實驗檢測了急、慢性鎘暴露后稀有鮈鯽血清生理生化指標以及有關(guān)脂滴形成、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和氧化相關(guān)基因的表達，以解釋脂滴增多原因。第四部分實驗檢測了急、慢性水體鎘暴露對應(yīng)激和代謝都有重要調(diào)節(jié)作用的H-P-I軸的激素含量以及信號通路相關(guān)的基因的表達水平，探討了稀有鮈鯽響應(yīng)于鎘暴露的應(yīng)激反應(yīng)。第五

4、部分實驗通過轉(zhuǎn)錄組分析，研究了水體75μg/L鎘暴露5w后稀有鮈鯽差異表達的基因，并檢測脂代謝相關(guān)基因在其它的急、慢性鎘暴露樣本的表達情況，結(jié)合血清GH家族激素以及血清炎癥因子的含量和表達，從而分析鎘導(dǎo)致的稀有鮈鯽生長干擾、脂代謝紊亂的潛在機制。
　　主要研究結(jié)果：
　　1）0-100μg/L鎘暴露5w后稀有鮈鯽的死亡率分別為2.56％，0%，27.91%，37.5%，57.5%，68.18%；75μg/L及以上濃度組稀有鮈

5、鯽肥滿度系數(shù)顯著（P<0.05）降低；25μg/L鎘暴露12周后實驗魚體重、空殼重、內(nèi)臟團重顯著（P<0.05）降低。
　　2）水體2.0-2.8 mg/L急性鎘暴露都會造成肝臟組織嚴重的損傷，形態(tài)上主要表現(xiàn)為細胞腫脹或皺縮、空泡化；5μg/L慢性鎘暴露對稀有鮈鯽肝臟形態(tài)上無明顯影響，25μg/L及以上濃度組實驗魚肝組織內(nèi)出現(xiàn)不同大小的空泡結(jié)構(gòu)，100μg/L濃度組細胞受損最嚴重。50和75μg/L濃度組肝臟嚴重變形，有多個腫瘤。

6、5-100μg/L慢性鎘暴露導(dǎo)致稀有鮈鯽肝細胞內(nèi)不同程度脂滴沉積，無劑量依賴效應(yīng)。
　　3）急性鎘暴露不同時間，表現(xiàn)出不同病理特征?？傮w上看，稀有鮈鯽肝細胞表現(xiàn)出糖原減少、細胞器壞死、髓樣小體增多、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（RER）異常增生或減少、線粒體腫脹、橋粒連接打開、枯否氏細胞增多、細胞壞死、細胞膜損傷、紅細胞浸潤等現(xiàn)象。急性鎘暴露72 h-96 h，肝細胞內(nèi)脂滴增多，并首次觀察到鎘誘導(dǎo)的細胞核脂滴。慢性鎘暴露后亞顯微水平的變化與急性鎘暴

7、露相似：肝細胞腫脹，糖原消失、自噬小體增多，低濃度組RER增生，高濃度組滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（SER）增生，細胞膜消失或細胞間隙增大，細胞內(nèi)有脂滴沉積。首次觀察到鎘誘導(dǎo)的RER同心圓小體和指紋狀板層小體。
　　4）稀有鮈鯽的Beclin1基因全長cDNA序列1940bp，與其它魚類及高等脊椎動物有高度相似性；該基因編碼的由447個氨基酸殘基組成的蛋白，含BH3、CCD、ECD結(jié)構(gòu)域，但CCD短于人和嚙齒類的長度。水體急性鎘暴露后，Becli

8、n1基因在鰓、腸顯著（P<0.05）升高，腦組織降低；水體慢性鎘暴露后，在腦組織顯著（P<0.05）上升，但在肝臟顯著（P<0.05）降低；Beclin1在幼魚響應(yīng)于5-100μg/L水體鎘暴露的表達變化具有時間和劑量依賴性效應(yīng)。
　　5）水體2.0 mg/L鎘暴露后，稀有鮈鯽血清中HDL-C、T-CHO、TG、ATP含量升高；肝臟HDL-C、T-CHO、TG、LDH和乳酸含量升高，CS酶活性降低；慢性鎘暴露后，HDL-C、T-C

9、HO、TG血清含量呈降低趨勢，肝臟內(nèi)TG顯著降低，但100μg/L組實驗魚肝臟T-CHO升高。
　　6）與組織學(xué)所觀察到的肝細胞內(nèi)的脂滴沉積現(xiàn)象相呼應(yīng)：負責(zé)脂質(zhì)回肝的HDL-C的主要蛋白成員APOAI基因，脂滴形成相關(guān)基因PLIN2、CAV2、CPTI、CPTII，脂質(zhì)代謝相關(guān)基因PPARr在急性2.0 mg/L鎘暴露96 h稀有鮈鯽肝臟顯著（P<0.05）升高；負責(zé)脂質(zhì)出肝的LDL-C主要蛋白成員APOB-100基因卻顯著（P<

10、0.05）降低。慢性鎘暴露5w后，血清中各種脂質(zhì)成分含量降低，但100μg/L鎘濃度組魚肝臟T-CHO含量升高；相關(guān)基因僅有CPTII基因在100μg/L濃度組實驗魚顯著（P<0.05）升高。
　　7）急性鎘暴露對稀有鮈鯽血清 MSH、Cortisol含量有顯著影響。Cortisol合成關(guān)鍵基因StAR、CYP11A1、CYP11B1表達量顯著（P<0.05）升高。Cortisol代謝關(guān)鍵基因11β-HSD2在多種組織表達量上升，

11、其在腎臟組織的酶活性含量也升高。Cortisol受體GR在鰓、腸、肌肉的表達顯著（P<0.05）降低，GR調(diào)節(jié)基因FKBP5在鰓和腸表達顯著（P<0.05）上升。H-P-I軸的CRH、ACTH含量無顯著變化，相關(guān)基因CRH、POMC、CRHR、MC2R基因在腦或腎臟的表達不受到鎘暴露的顯著影響。50μg/L以上濃度鎘暴露5w，稀有鮈鯽血清CRH、ACTH、MSH、Cortisol都顯著（P<0.05）升高，100μg/L組實驗魚CRH、

12、MC2R、StAR、CYP11A1、CYP11B1表達量顯著（P<0.05）升高，GR表達無顯著變化，但FKBP5在鰓和腸顯著（P<0.05）升高。
　　8）稀有鮈鯽肝臟中表達量最高的60個基因可分為脂質(zhì)代謝、消化酶、繁殖、鐵或鈣離子轉(zhuǎn)運、呼吸鏈和凝血、先天免疫和應(yīng)激反應(yīng)、蛋白合成與降解七類。75μg/L鎘暴露后，稀有鮈鯽肝臟組織篩選出288個差異表達基因，其中192個下調(diào)。運用RT-qPCR驗證了部分基因的表達。
　　9）

13、水體75μg/L鎘暴露5w后，從肝臟組織篩選出差異表達基因，其中51個與離子結(jié)合相關(guān)，27個與鋅離子有關(guān)，8個分別與鐵和鈣離子有關(guān)；33個與脂質(zhì)消化吸收和代謝相關(guān)，包括SCD，PEPC等；與氧化應(yīng)激相關(guān)的18個；與生長相關(guān)的基因11個，包括IGF1。
　　10）鎘暴露造成編碼GH家族激素基因合成和分泌紊亂；血清炎癥因子含量發(fā)生顯著變化。VtgAO1和SCD基因在慢性鎘暴露所有濃度組和急性鎘暴露的所有時間點都顯著（P<0.05）降低

14、。
　　主要研究結(jié)論：
　　1）水體慢性鎘暴露導(dǎo)致稀有鮈鯽生長停滯、肥滿度系數(shù)降低，提示鎘暴露后實驗魚能量存儲減少，代謝發(fā)生紊亂。
　　2）鎘對稀有鮈鯽的毒性復(fù)雜，具有劑量和暴露時間的特異性；急、慢性鎘暴露都可造成肝臟組織嚴重損傷，凋亡、自噬等調(diào)節(jié)細胞程序性死亡的生命過程紊亂；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的動態(tài)變化過程提示其在鎘應(yīng)激反應(yīng)中具有重要功能。肝細胞功能減退，糖、脂代謝紊亂，伴隨有炎癥發(fā)生。一定濃度慢性鎘暴露對稀有鮈鯽具有促進肝細胞

15、增生和異變結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的作用。
　　3）稀有鮈鯽 Beclin1基因與其它脊椎動物相應(yīng)基因具有高度同源性，該基因在稀有鮈鯽胚胎、胚后的整個生長發(fā)育階段具有重要的作用，可能參與了水體鎘暴露導(dǎo)致肝細胞自噬發(fā)生。另外，Beclin1可以作為以稀有鮈鯽幼魚為對象的水環(huán)境鎘暴露污染輔助生物指標。
　　4）急性鎘暴露后稀有鮈鯽脂代謝的紊亂與脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運紊亂有關(guān)，并通過PLIN2、CAV2、PPARr、CPTII介導(dǎo)的代謝通路而調(diào)節(jié)脂滴形成。慢

16、性鎘暴露后稀有鮈鯽各器官的脂肪會被氧化分解，導(dǎo)致肥滿度系數(shù)、內(nèi)臟團重等顯著降低，但肝臟組織T-CHO的含量升高，說明T-CHO的轉(zhuǎn)運紊亂可能與慢性鎘暴露脂滴沉積和脂代謝紊亂有關(guān)。
　　5）急性鎘暴露主要影響稀有鮈鯽H-P-I軸Cortisol的分泌和合成及其下游的GR的表達；并假設(shè)鎘介導(dǎo)的Cortisol合成不是通過CRH-ACTH信號通路，而以MSH或其它激素介導(dǎo)的信號實現(xiàn)；然而通過FKBP5介導(dǎo)的GR下調(diào)和11β-HSD2的表

17、達升高可以作為負反饋調(diào)節(jié)有利于緩解Cortisol紊亂帶來的毒性。慢性鎘暴露會影響H-P-I軸的所有激素的分泌，高濃度也會導(dǎo)致其基因表達和激素合成紊亂，并通過 ACTH-MC2R的信號通路控制 Cortisol的合成；FKBP5可能通過降低GR的活性而非表達而抑制Cortisol效應(yīng)。
　　6）稀有鮈鯽的肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示了肝臟具有調(diào)節(jié)消化吸收、免疫、生殖、蛋白合成等功能。鎘暴露后，肝臟組織的離子平衡、氧化應(yīng)激水平、脂肪的消化吸收