膿毒癥氧化應(yīng)激的臨床研究及丙酮酸乙酯對(duì)膿毒癥小鼠氧化應(yīng)激肝細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、外科感染是術(shù)后常見(jiàn)并發(fā)癥之一，感染導(dǎo)致膿毒癥的直接后果是手術(shù)患者死亡率上升。機(jī)體在膿毒癥狀態(tài)下產(chǎn)生過(guò)量的活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)導(dǎo)致氧化-還原不平衡狀態(tài)，稱為氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的ROS是細(xì)胞內(nèi)主要的信號(hào)傳導(dǎo)第二信使系統(tǒng)，ROS使一些具有特定功能的細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄增加，促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞因子釋放，引起失控的炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)所謂“炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)效應(yīng)”，其結(jié)果造成組織細(xì)胞損傷和毛細(xì)血管通透性增加，最終出現(xiàn)多個(gè)器

2、官功能障礙。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果已經(jīng)表明氧化應(yīng)激與器官功能受損直接相關(guān)，膿毒癥產(chǎn)生的ROS可導(dǎo)致心臟、胃腸道、腎臟、肺、肝臟功能受損。肝臟是膿毒性休克中首先表現(xiàn)出損傷的器官，在膿毒癥早期即可出現(xiàn)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素升高。由于肝臟的Kuffer細(xì)胞充當(dāng)體內(nèi)“清道夫”，肝細(xì)胞受損的結(jié)果是細(xì)菌及其產(chǎn)物清除障礙，體內(nèi)炎癥反應(yīng)得不到遏制，而持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)又會(huì)加重肝功能損害。目前認(rèn)為膿毒癥時(shí)肝細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變和它介導(dǎo)的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致

3、肝細(xì)胞損傷的主要因素。本課題前期著重在臨床研究外科膿毒癥患者的體內(nèi)氧化還原狀態(tài)及其對(duì)器官功能的影響，以獲取膿毒癥患者氧化還原狀態(tài)的資料。在此基礎(chǔ)上深入研究膿毒癥發(fā)病過(guò)程中肝臟的氧化還原狀態(tài)，研究丙酮酸乙酯(ethylpyruvate，EP)保護(hù)膿毒癥小鼠肝細(xì)胞的作用機(jī)制，探索膿毒癥的新型防治策略。 材料與方法：臨床研究中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科ICU患者31例，根據(jù)有無(wú)感染將病例分為兩組：膿毒癥15例，非膿毒癥16例，研究對(duì)象進(jìn)入

4、ICU后第1，3天抽血留取樣本，測(cè)定血清丙二醛(malonaldehyde，MDA)濃度，同時(shí)在相應(yīng)時(shí)間記錄患者出現(xiàn)功能障礙的器官數(shù)目。 實(shí)驗(yàn)研究制作小鼠盲腸結(jié)扎穿孔(cecalligation-perforation，CLP)模型，應(yīng)用含抗氧化劑的丙酮酸乙酯林格氏液(Ringer'sethylpyruvatesolution，REPS)與乳酸鈉林格氏液(Ringer'slacticsolution，RLS)進(jìn)行膿毒癥液體復(fù)蘇，

5、根據(jù)所用復(fù)蘇液體的不同將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為假手術(shù)組(n=20)、CLP模型+REPS組(n=20)、CLP模型+RLS組(n=20)。制作膿毒癥模型后第18小時(shí)將動(dòng)物處死，留取血清和肝組織標(biāo)本待測(cè)。應(yīng)用比色法測(cè)定肝組織MDA、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、總抗氧化能力(totalantioxidativecapability，T-AOC)、一氧化氮(nitricoxidase，N0)濃度及血清N0、丙氨酸轉(zhuǎn)

6、氨酶(alanineaminotransferase，ALT)、血乳酸濃度；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定血清腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactoralpha，TNFα)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)6、IL-10濃度；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定肝組織細(xì)胞TNFαmRNA、IL-6mRNA、iNOSmRNA表達(dá)量；應(yīng)用免疫組化法測(cè)定肝細(xì)胞熱休克蛋白70(heatshockprotein70，HSP70)的表達(dá)

7、量。 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)和直線相關(guān)分析，p＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 第一部分膿毒癥組患者M(jìn)DA水平較為非膿毒癥組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)；膿毒癥組患者第一、三天的MDA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。非膿毒癥組患者的MDA在第三天顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。隨著MDA水平的增高，患者受損器官的數(shù)目有增加

8、趨勢(shì)，Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)r=0.850，顯示MDA與器官功能障礙存在相關(guān)性(P＜0.01)。 第二部分CLP小鼠體內(nèi)抗氧化能力降低，MDA數(shù)值較假手術(shù)組增高，SOD、T-AOC數(shù)值較假手術(shù)組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；EP可增加抗氧化能力，與RLS組相比，REPS組MDA數(shù)值降低，SOD、T-AOC數(shù)值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。REPS組血乳酸值較RLS組顯著性降低，p＜0.01。REPS組血

9、清ALT較RLS組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。 第三部分與RLS組比較，REPS組血清TNFα、IL-6、NO濃度降低，IL-10濃度增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)；REPS組IL-6/IL-10比值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；血清N0濃度與肝組織N0濃度有良好的相關(guān)關(guān)系，r=0.833，p＜0.05。 肝細(xì)胞TNFαmRNA、IL-6mRNA、iNOSmRNA表達(dá)在REPS組較RLS組低

10、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。 第四部分REPS組HSP70陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞顯著增多，t檢驗(yàn)顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.05。 結(jié)論 本研究結(jié)果表明： 1、臨床膿毒癥患者體內(nèi)存在嚴(yán)重氧化應(yīng)激狀態(tài)，氧化應(yīng)激與器官功能障礙相關(guān)。 2、丙酮酸乙酯具有顯著的抗氧化效應(yīng)，提高膿毒癥肝細(xì)胞的抗氧化能力，從而改善肝功能。 3、丙酮酸乙酯改善微循環(huán)狀態(tài)和細(xì)胞能量代謝狀態(tài)，有效降低血乳酸水平。