三疣梭子蟹卵巢發(fā)育期間卵黃蛋白原(Vg)、卵黃磷蛋白(Vn)及Vg-mRNA表達(dá)的變化研究.pdf

1、三疣梭子蟹是我國海產(chǎn)重要經(jīng)濟(jì)蟹類之一，由于池塘養(yǎng)殖親本通常存在卵巢發(fā)育不良和生殖性能差等缺點，故目前繁殖親本主要來源野生.因此，研究和了解三疣梭子蟹的卵黃發(fā)生規(guī)律和調(diào)控機(jī)制顯得十分迫切.鑒于此，本文首先分離和純化了三疣梭子蟹卵黃磷蛋白(Vn)，在此基礎(chǔ)上建立卵黃蛋白原。Vg/Vn測定的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，然后系統(tǒng)研究了三疣梭子蟹卵巢發(fā)育期間卵巢、肝胰腺和血淋巴中Vg/Vn的含量，最后測定了三疣梭子蟹不同卵巢發(fā)育時期卵巢和肝胰腺

2、中的卵黃蛋白原基因(Vg-mRNA)的豐度，結(jié)果不僅可為深入了解三疣梭子蟹的卵黃發(fā)生機(jī)制提供基礎(chǔ)資料，也可為三疣梭子蟹的卵巢發(fā)育調(diào)控和親本質(zhì)量評價提供依據(jù)。
　　 1.采用凝膠過濾層析法純化了三疣梭子蟹成熟卵巢的卵黃磷蛋白(Vitellin，Vn)，采用變性凝膠電泳(SDS-PAGE)確定了Vn亞基數(shù)量和分子量，以純化的Vn為抗原，制備了三疣梭子蟹Vn多克隆抗血清，純化后得到Vn抗體，在此基礎(chǔ)了比較和優(yōu)化了三疣梭子蟹Vn測定的酶

3、聯(lián)免疫吸附法(ELISA)參數(shù)，建立了穩(wěn)定的三疣梭子蟹Vn含量測定的ELISA方法.結(jié)果表明：(1)SDS-PAGE顯示三疣梭子蟹成熟卵巢中的Vn含有分子量為100kDa、75kDa和66kDa的三個亞基，Western-blotting檢測表明：(1)這三個亞基均具有較強(qiáng)的免疫特異性；(2)樣品直接包被法比雙抗體夾心法具有更高的線性相關(guān)性，Vn抗體最佳稀釋倍數(shù)為1:90000，最佳包被時間為8小時，一抗和二抗反應(yīng)時間分別為2小時和1小

4、時，顯色時間為20分鐘；(3)該方法定性檢測的靈敏度為14.9ng/mL左右，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0009x++0.3991(R2=0.9861)，其中x和y分別代表Vn濃度和OD450值，工作范圍為200-900ng/mL；(4)應(yīng)用該方法測定三疣梭子蟹卵巢中Vn含量，結(jié)果表明批次內(nèi)和批次間平均變異系數(shù)分別為3.59％和3.10％，重復(fù)性良好.
　　 2.卵黃蛋白是甲殼動物成熟卵巢和胚胎最重要的營養(yǎng)物質(zhì)，他對于甲殼動物生殖起

5、著極為重要的作用.本研究采用考馬氏亮藍(lán)法和酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-LinkedImmunoabsorbentAssay，ELISA)系統(tǒng)測定了三疣梭子蟹卵巢發(fā)育期間卵巢、肝胰腺和血淋巴中的可溶性總蛋白和卵黃磷蛋白的含量(Vn/Vg)含量，并對Vn含量與卵巢發(fā)育的相關(guān)性進(jìn)行了探討.結(jié)果表明：(1)卵巢發(fā)育期間，卵巢指數(shù)(GSI)顯著增長，肝胰腺指數(shù)(HSI)為先下降后上升再下降趨勢，肝胰腺指數(shù)和卵巢指數(shù)并無顯著相關(guān)性；(2)卵巢發(fā)育

6、期間，卵巢中的可溶性總蛋白呈顯著上升趨勢，肝胰腺中的總蛋白為中間高兩頭低趨勢，血淋巴中總蛋白為前期低，中后期高；(3)卵巢發(fā)育期間，卵巢中的Vn顯著上升，最高值在Ⅴ期，高達(dá)256.93mg/g濕重，總可溶性蛋白中超過80％的為Vn；Ⅰ和Ⅱ期肝胰腺中檢測不出Vg，此后開始顯著上升，血淋巴中的Vn含量在Ⅱ-Ⅳ期顯著上升，Ⅴ顯著下降，僅為3.48μg/ml.以上結(jié)果暗示，三疣梭子蟹卵巢發(fā)育中后期卵黃蛋白主要來源于肝胰腺合成，然后通過血淋巴運(yùn)輸

7、到卵巢中；卵巢發(fā)育成熟后，肝胰腺中VgmRNA豐度和血淋巴中的Vn含量大幅度下降，這說明成熟期的三疣梭子蟹的外源性卵黃蛋白合成較少.
　　 3.使用實時熒光定量PCR的方法，對不同發(fā)育時期的雌性三疣梭子蟹肝胰腺和卵巢組織中Vg-mRNA進(jìn)行了測定，結(jié)果表明Vg-mRNA在卵巢和肝胰腺內(nèi)均有表達(dá)，卵巢中表達(dá)量遠(yuǎn)低于肝胰腺。卵巢發(fā)育過程中，肝胰腺和卵巢中Vg-mRNA變化模式有所不同，肝胰腺中Vg-mRNA為先上升后下降趨勢，最高值