雙齒圍沙蠶雌激素受體和卵黃蛋白原基因的克隆及在苯并(a)芘誘導(dǎo)下的表達(dá)特征.pdf

1、越來(lái)越多的研究表明了雌激素受體(estrogen receptor, ER)基因和卵黃蛋白原(vitellogenin,VTG)基因?qū)Νh(huán)境污染物尤其是內(nèi)分泌干擾物相當(dāng)敏感,二者經(jīng)常被用作檢測(cè)污染物的生物標(biāo)志物,在環(huán)境分泌干擾物污染風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)中發(fā)揮著重要作用。目前也已經(jīng)從多種脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中得到了它們的基因全長(zhǎng),但是作為環(huán)境污染物的指示生物—雙齒圍沙蠶ER和VTG基因的獲得尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以雙齒圍沙蠶(Perinereis a

2、ibuhitensis)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中已有的ER和VTG中間序列片段為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物,利用cDNA快速末端擴(kuò)增法(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)進(jìn)行雙齒圍沙蠶ER和VTG基因全長(zhǎng)cDNA序列擴(kuò)增,并對(duì)獲得的全長(zhǎng)基因序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),對(duì)苯并(a)芘(benzo(a) pyrene,B(a)P)誘導(dǎo)下雙齒圍沙蠶體壁中ER和VTG基因表達(dá)變化特征進(jìn)行分析。具體結(jié)果如下:

3、　　1.雙齒圍沙蠶ER基因cDNA全長(zhǎng)2793bp,其中包括114bp的5ˊ端非編碼區(qū),1398bp的3ˊ端非翻譯區(qū)和1281bp的開(kāi)放閱讀框,編碼426個(gè)氨基酸。該序列已上傳至NCBI, GENBANK號(hào)為KF673856。序列分析發(fā)現(xiàn)該蛋白具有DNA結(jié)合區(qū)(88-163)和配體結(jié)合區(qū)(239-419), DNA結(jié)合區(qū)中包括兩個(gè)核受體 C4類(lèi)型的鋅指結(jié)構(gòu)CLVCGDVASGYHYGVASCEAC(91-111)和CPANGICEITK

4、RRRKACQAC(127-146)。生物信息學(xué)分析表明,該序列編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為47643.5Da,理論等電點(diǎn)為5.45,不具有信號(hào)肽位點(diǎn)和跨膜區(qū),推測(cè)該蛋白為親水性蛋白。多序列比對(duì)結(jié)果顯示雙齒圍沙蠶ER氨基酸序列與部分軟體動(dòng)物、魚(yú)類(lèi)、哺乳類(lèi)以及兩棲類(lèi)的 ER蛋白序列同源性介于55％-59％。
　　2.雙齒圍沙蠶VTG基因cDNA全長(zhǎng)5325bp,其中5ˊ端非翻譯區(qū)為47 bp,3ˊ端非翻譯區(qū)為199bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)?07

5、9bp,編碼一個(gè)由1692個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。該序列已上傳至NCBI,GENBANK號(hào)為KF212194。該蛋白具有1個(gè)Vitellogenin結(jié)構(gòu)域(31-718)和1個(gè)VWFD結(jié)構(gòu)域(1401-1613)。通過(guò)生物信息學(xué)分析表明,該序列編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為185270.5Da,理論等電點(diǎn)為8.66,具有信號(hào)肽位點(diǎn),無(wú)跨膜區(qū),推測(cè)為分泌蛋白。同源性分析表明,雙齒圍沙蠶VTG氨基酸序列與部分軟體動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)的同源性很低,介于21％-2

6、7％之間。
　　3. B(a)P暴露下雙齒圍沙蠶ER mRNA的表達(dá)量隨著暴露天數(shù)的延長(zhǎng)出現(xiàn)上升趨勢(shì),0.5μg/L B(a)P組在4、7和14天時(shí)ER mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為空白對(duì)照組的0.64倍、1.33倍、2.32倍;5μg/L B(a)P組分別為空白對(duì)照組的1.21倍、1.38倍、1.61倍;50μg/L B(a)P組分別為空白對(duì)照組的0.66倍、1.07倍、1.85倍。其中低劑量組(0.5μg/L)誘導(dǎo)ER轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)