桔小實蠅抗熱脅迫反應的機制研究.pdf

1、桔小實蠅Bactrocera dorsalis隸屬于雙翅目Diptera，實蠅科Tephritidae，是一種重要的世界性害蟲。該蟲可為害46個科的250多種水果和蔬菜，并造成嚴重的經(jīng)濟損失。桔小實蠅具有很強的擴散性和環(huán)境適應性，能進行遠距離擴散并迅速占領入侵地。該蟲原產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，現(xiàn)已成為中國南部、東南亞、印度次大陸和夏威夷群島危險性果蔬害蟲，這些地區(qū)的夏季高溫往往高于40℃；隨著全球氣候變暖，桔小實蠅逐漸向高緯度地區(qū)擴散，在

2、中國湖北、江蘇等冬季溫度低于0℃的地區(qū)也可完成越冬。桔小實蠅適宜發(fā)育的溫度范圍在15～34℃之間，因此，夏季高溫和冬季低溫等極端溫度必將對桔小實蠅造成熱脅迫。在長期的進化過程中，桔小實蠅形成了一系列反應機制來應對熱脅迫。熱激蛋白是細胞或生物體在受熱或其他因素刺激后，所產(chǎn)生的一類在生物進化中最保守并由熱休克基因所編碼的伴隨細胞蛋白，與生物體的熱耐受性和抗逆性有重要的關系。熱脅迫帶來的氧化壓力使生物體內(nèi)產(chǎn)生過氧化反應，而抗氧化系統(tǒng)則可以清除

3、氧自由基，緩解氧化壓力，修復脅迫損傷等。以雙向電泳和質(zhì)譜鑒定技術(shù)為核心的蛋白質(zhì)組學的發(fā)展為分離鑒定昆蟲體內(nèi)的蛋白質(zhì)創(chuàng)造了有利條件。差異蛋白質(zhì)組學的興起，更是為分離已知的熱脅迫應激蛋白，以及去尋找那在抗熱脅迫響應過程中起作用的未知蛋白提供了有利工具。
　　 本學位論文以桔小實蠅為研究對象，在全球氣候變暖的大環(huán)境下，瞄準生物適應熱脅迫這一國際研究熱點，利用差異蛋白質(zhì)組學方法分離并鑒定了熱脅迫下桔小實蠅的響應蛋白；采用微量滴定酶標板法

4、測定了其體內(nèi)抗氧化酶活性的變化；利用RT-PCR、RACE及qPCR等技術(shù)克隆并解析了桔小實蠅熱激蛋白基因和抗氧化酶基因及其轉(zhuǎn)錄表達模式，從不同角度闡明了桔小實蠅對熱脅迫的響應機制。經(jīng)過近3年的研究，獲得以下主要結(jié)果：
　　 1.桔小實蠅在熱脅迫下的抗氧化反應
　　 丙二醛(MDA)是多元未飽和脂肪酸過氧化反應的主要氧化產(chǎn)物，可以通過測定其含量來明確脂質(zhì)過氧化的水平(LPO)，因此MDA已被作為氧化脅迫的一個生物標識。高

5、溫和低溫脅迫下桔小實蠅體內(nèi)的MDA含量都較對照27℃顯著升高，說明熱脅迫打破了桔小實蠅體內(nèi)氧化還原反應的平衡，誘導了體內(nèi)抗氧化酶活性增強。桔小實蠅遭受熱脅迫后，其體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)的活性顯著升高，催化體內(nèi)因氧化脅迫而產(chǎn)生的高濃度超氧陰離子(O2°-)發(fā)生歧化反應生成過氧化氫(H2O2)。隨著溫度極端升高和降低，SOD活性升高，同時隨著脅迫時間延長而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。過氧化氫酶(CAT)活性較27℃顯著增強，分解過量的H2

6、O2，生成對機體無害的H2O和O2，以降低體內(nèi)活性氧(ROS)的含量而緩解氧化壓力；隨著溫度極端升高和降低，CAT活性升高，同時隨著脅迫時間的延長，CAT活性也呈現(xiàn)上升后又下降的變化趨勢。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的活性也發(fā)生了顯著的變化，高溫脅迫下顯著升高，低溫脅迫下隨著脅迫時間的延長，GST活性下降后又快速上升并高于對照27℃下的活性；GST活性升高，分解過多的脂類過氧化物，在桔小實蠅抗熱脅迫導致的氧化脅迫反應中發(fā)揮了重要作用。過

7、氧化物酶(POD)和總抗氧化能力(T-AOC)以較高的活性值穩(wěn)定地發(fā)揮著抗氧化脅迫的作用。
　　 2.桔小實蠅在熱脅迫下的差異蛋白質(zhì)組學研究
　　 雙向電泳是一種對生物體內(nèi)復雜蛋白質(zhì)體系進行高效分離的技術(shù)，分辨率高、重復性好和穩(wěn)定性強是其最基本的特征。蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量直接影響雙向電泳的分離效果和生物信息的完整性。本研究選擇桔小實蠅體內(nèi)的總蛋白進行分析，建立了一套穩(wěn)定、重復性好的雙向電泳技術(shù)體系，全面挖掘桔小實蠅響應抗熱脅

8、迫反應的功能蛋白：通過在常規(guī)裂解液中引入2M硫脲提高了蛋白質(zhì)特別是疏水蛋白的溶解性；繼而利用蛋白質(zhì)純化試劑盒純化獲得了高質(zhì)量的蛋白質(zhì)樣品；在膠條平衡緩沖液中增加了甘油和SDS的含量提高了平衡效果；PAGE凝膠經(jīng)質(zhì)譜兼容的銀染方法染色，最終獲得了高分辨率的雙向電泳圖譜。上述雙向電泳技術(shù)體系的建立為分離和鑒定桔小實蠅抗熱脅迫響應蛋白質(zhì)奠定了堅實基礎。
　　 利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對桔小實蠅抗熱脅迫的響應機制進行了研究。將試蟲在40℃高溫

9、和0℃低溫下脅迫3h后，提取總蛋白質(zhì)，使用pH3～10、17cm的膠條和10％SDS-PAGE凝膠進行雙向電泳。經(jīng)PDQuest V8.0.1軟件分析，三組雙向電泳圖譜具有較高的匹配率。使用PDQuest自動匹配功能，結(jié)合人工增加和去除蛋白點，以27℃為對照，確定了61個差異較大的蛋白質(zhì)。在熱脅迫中表達一致的有37個，其中上調(diào)30個，下調(diào)7個。經(jīng)MALDI-TOF-TOF串聯(lián)質(zhì)譜測序分析，成功鑒定出40個蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)中含有15個與

10、氧化還原相關的酶類蛋白，如Superoxide dismutase、Peroxiredoxin1、Cytochrome P450和Respiratory-chainNADH dehydrogenase等；有8個各類離子和代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)移酶，如Peptide-O-fucosyltransferase、Glutathione S-transferase和Guanidophosphotransferase等；還有各種激酶和線粒體糖蛋白以及熱激蛋

11、白Hsps等。
　　 3.桔小實蠅熱激蛋白基因克隆、序列分析和mRNA表達模式解析
　　 利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)，克隆獲得了4條Hsps編碼基因，其中1條Hsp90家族基因BdHsp901，2條Hsp70家族基因BD1和BD2，1條Hsp60家族基因Hsp60；并從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載其他昆蟲的Hsps氨基酸序列，采用軟件MEGA4.0用鄰接法(Neighbor-joining method，N-J法)構(gòu)

12、建了上述4條桔小實蠅Hsps基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，確定了它們的分類關系；以桔小實蠅的actin基因(GenBank登錄號L12254)為內(nèi)參，采用實時熒光定量qPCR技術(shù)測定了這4個Hsps蛋白質(zhì)編碼基因在熱脅迫下的mRNA表達模式。
　　 桔小實蠅Hsp90家族基因BdHsp901的全長cDNA序列在GenBank中的登錄號為JN168997。該基因全長2621bp，開放閱讀框2148bp，編碼715個氨基酸。具有1個Hsp9

13、0家族簽名序列(signature)YSNKEIFLRE，根據(jù)C-端基序MEEVD確定其為胞質(zhì)型熱激蛋白。從建立的系統(tǒng)發(fā)育樹中發(fā)現(xiàn)，BdHsp901編碼的氨基酸序列和地中海實蠅Ceratitis capitata的關系最近，它們最先聚為一支，然后與刺舌蠅Glossina morsitans聚為一支，而與鱗翅目的親緣關系較遠。高溫脅迫3h后，BdHsp901的表達顯著上調(diào)，說明桔小實蠅通過體內(nèi)大量積累該基因編碼的蛋白質(zhì)以適應來自環(huán)境高溫的

14、脅迫壓力。Hsp90家族熱激蛋白是生物體內(nèi)含量最高的蛋白之一，但低溫脅迫只有在極端低溫-5℃誘導3h后才發(fā)生了顯著上調(diào)，這說明在其他的低溫下體內(nèi)BdHsp901正常的高含量足以保護細胞不受脅迫傷害。
　　 兩個Hsp70家族熱激蛋白BD1和BD2在GenBank中的登錄號分別是GU591408和GU591409。BD1基因cDNA全長2086 bp，開放閱讀框1962 bp，編碼653個氨基酸，具有3個Hsp70家族簽名序列ID

15、LGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL和IVLVGGSTRIPKVQR。BD2基因cDNA全長2258 bp，開放閱讀框1911 bp，編碼636個氨基酸，具有2個Hsp70家族簽名序列IDLGTTYS和IFDLGGGTFDVSIL。兩者都具有非細胞器基序RARFEEL、C-端高度保守的細胞質(zhì)Hsps基序EEVD以及雙組份細胞核定位信號KK和RRLRT。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果分析表明，兩個Hsp70家族基因都與雙翅目實蠅類害蟲關系較近。高溫

16、脅迫后BD1表達量有所下調(diào)，而BD2的表達顯著上調(diào)，說明BD2與桔小實蠅抗熱脅迫有直接關系，而BD1可能是在其他生理活動中發(fā)揮作用。
　　 克隆獲得的Hsp60家族熱激蛋白Hsp60在GenBank中的登錄號為JF812645，基因cDNA全長2042 bp，開放閱讀框1722 bp，編碼573個氨基酸，具有分子伴侶Chaperonins cpn60的簽名序列AAVEEGIVPGGG。含有典型的頂區(qū)、赤道區(qū)和中間區(qū)三個區(qū)域和兩個

17、ATP/ADP結(jié)合位點以及一個Mg2+結(jié)合位點和一個底物結(jié)合位點，C-端有Hsp60家族特有的(GGM)n重復區(qū)域。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，Hsp60和包括果蠅類的雙翅目害蟲關系較近。熱脅迫后Hsp60基因mRNA表達量顯著升高，說明它參與了桔小實蠅抗熱脅迫反應并發(fā)揮著重要的作用。
　　 4.桔小實蠅抗氧化酶基因的克隆、序列分析和mRNA表達模式解析
　　 利用桔小實蠅轉(zhuǎn)錄組序列信息，通過RACE技術(shù)，克隆獲得了1條過氧化物

18、酶(POD)的全長cDNA序列，命名為BdpoxAl，在GenBank中的登錄號JN003585。BdpoxAl基因cDNA全長2549 bp，開放閱讀框2106 bp，編碼701個氨基酸，具有1個活性位點、1個過度穩(wěn)定位點和6個金屬(鈣)特征位點以及4個二硫化物特征序列區(qū)域。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，它首先和麗蠅蛹金小蜂Nasonia vitripennis聚為一支，然后又與雙翅目的致倦庫蚊Culex quinquefasciatus聚在一

19、起。由此推斷，桔小實蠅與麗蠅蛹金小蜂較近的親緣關系可能是麗蠅蛹金小蜂在和寄主麗蠅類昆蟲的協(xié)同進化中，基因發(fā)生了趨異進化，從而更有利于自身對麗蠅類昆蟲的寄生。測定結(jié)果表明，熱脅迫后的BdpoxAl的mRNA表達量和酶活性的表達量變化趨勢一致，即35℃條件下表達上調(diào)，其他各溫度條件下都略微下調(diào)，這說明BdpoxAl編碼的過氧化物酶可能是一種組成性的蛋白質(zhì)，不論是在逆境還是正常條件下，都能穩(wěn)定地分解桔小實蠅體內(nèi)的H2O2。
　　 同樣

20、的方法克隆得到一條超氧化物歧化酶(SOD)的全長cDNA序列Bdsodl，它在GenBank中的登錄號為JQ713828。Bdsodl基因cDNA全長946 bp，開放閱讀框807 bp，編碼268個氨基酸，具有1個Cu/Zn SOD簽名序列GNAGERIACGII和6個活性位點。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，Bdsodl和地中海實蠅聚為一支，具有較近的親緣關系，這與傳統(tǒng)上的分類關系是一致的。在熱脅迫下，Bdsodl mRNA表達水平上調(diào)，結(jié)合酶

21、活性的升高，表明更多的超氧化物歧化酶催化超氧陰離子的歧化反應，充分反映了SOD在桔小實蠅抗熱脅迫響應中的重要意義。
　　 綜上所述，本研究基于全球氣候變暖這一特點，圍繞生物和環(huán)境溫度變化之間的關系，以重要果蔬害蟲桔小實蠅為研究對象，從生理生化和分子生物學水平全面、系統(tǒng)地研究了環(huán)境極端溫度對桔小實蠅的影響以及桔小實蠅抗環(huán)境熱脅迫的分子響應機制。首先，通過研究桔小實蠅在熱脅迫下抗氧化酶系統(tǒng)的活性變化，明確了抗氧化酶的作用機制。其次，

22、在成功建立桔小實蠅成蟲總蛋白雙向電泳技術(shù)體系的基礎之上，通過差異蛋白質(zhì)組學研究，明確了在熱脅迫下桔小實蠅體內(nèi)蛋白質(zhì)的變化模式和表達水平，并確定了主要的響應蛋白質(zhì)的種類和功能。最后，克隆了相關的4條熱激蛋白Hsps和2條抗氧化酶基因全長cDNA序列，并利用實時定量qPCR技術(shù)探討了它們在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上的表達模式，揭示了它們在桔小實蠅抗熱脅迫反應中的作用機制。本研究綜合運用昆蟲生理生化和分子生物學前沿技術(shù)，特別是差異蛋白質(zhì)組學技術(shù)，全面