毛乳頭細(xì)胞HSPC016基因的全長(zhǎng)cDNA克隆及功能分析.pdf

1、分布于體表的毛發(fā)具有調(diào)節(jié)體溫、排泄代謝物、緩沖外界機(jī)械壓力等生理功能。對(duì)人類而言，毛發(fā)還具有社交媒介功能。分布于顏面、頭皮、外陰等處的毛發(fā)因毛干形態(tài)、色澤、密度各異而賦予個(gè)體不同的生理特征，在社會(huì)交往中給人以美的享受。因毛發(fā)生長(zhǎng)異常而發(fā)生斑禿、多毛的患者往往承受極大的心理壓力，生活質(zhì)量受到影響。因此，弄清毛發(fā)胚胎期發(fā)生以及成熟毛發(fā)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的機(jī)制，發(fā)展有效治療毛發(fā)疾病的藥物是目前毛囊生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。 人類迄今對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的了解

2、主要來(lái)源于臨床觀察。通過(guò)對(duì)小鼠/大鼠模型的研究，一些與毛囊周期有關(guān)的調(diào)節(jié)分子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibobalastgrowthfactors，F(xiàn)GFs)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticproteins，BMPs)、刺猬蛋白(sonichedgehog，Shh)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophins)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(plateletderivedgrowthfactor，PDGF)等被相繼鑒定出來(lái)。組成毛

3、囊的細(xì)胞，如DPC、外根鞘細(xì)胞(outrootsheath，ORS)、毛母質(zhì)細(xì)胞等可分泌這些生長(zhǎng)因子及其受體；而且就單一細(xì)胞因子而言，其產(chǎn)生和分泌都與毛囊周期的特定時(shí)相有關(guān)。但是，關(guān)于這些細(xì)胞因子調(diào)節(jié)毛囊發(fā)生和毛囊周期的具體分子機(jī)制，如通過(guò)什么信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、與什么分子作用等均不十分清楚。 Inamatsu等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)凝集生長(zhǎng)狀態(tài)的DPC仍能保持誘導(dǎo)毛囊發(fā)生的能力。為了探索哪些基因在DPC凝集生長(zhǎng)狀態(tài)下表達(dá)，篩選與DPC凝集生長(zhǎng)

4、相關(guān)的基因，宋志強(qiáng)等通過(guò)抑制性消減雜交技術(shù)建立了人類DPC消減cDNA文庫(kù)，并從凝集生長(zhǎng)狀態(tài)的DPC篩選出一批表達(dá)上調(diào)和表達(dá)下調(diào)基因。HSPC016即是通過(guò)上述方法篩選出的與DPC凝集生長(zhǎng)相關(guān)的基因，它首次從CD34+造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞(CD34+hematopoieticstem/progenitorcells，HSPC)中分離鑒定，但功能不清。鑒于DPC具有干細(xì)胞的特點(diǎn)，如自我更新能力、凝集性生長(zhǎng)、處于愛(ài)保護(hù)的隱蔽位置、血供豐富等，

5、更有學(xué)者將DPC轉(zhuǎn)化為紅系及髓系血細(xì)胞并能在動(dòng)物體內(nèi)維持達(dá)1年之久，我們推測(cè)HSPC016對(duì)維持DPC凝集性生長(zhǎng)及其功能可能發(fā)揮重要作用。因此，本實(shí)驗(yàn)首先從人頭皮毛囊中分離獲得DPC并建立DPC體外培養(yǎng)體系，進(jìn)而使用RACE(rapidamplificationofcDNAends)技術(shù)對(duì)HSPC016在DPC內(nèi)表達(dá)的全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行克隆，利用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)其氨基酸序列及可能的功能，通過(guò)RNAi技術(shù)對(duì)其功能進(jìn)行初步驗(yàn)證分析。

6、 本課題研究結(jié)果顯示，DPC內(nèi)兩條HSPC016基因亞型的全長(zhǎng)cDNA分別為400bp(GenBank序列號(hào)AY508979)和493bp(GenBank序列號(hào))，為一進(jìn)化保守基因。生物信息學(xué)分析及聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢顯示HSPC016定位于染色體3q21.31；此基因包含一個(gè)195bp的開(kāi)放讀框，預(yù)測(cè)蛋白為64aa小分子量可溶性蛋白，存在于核內(nèi)的可能性為56.5％，胞漿為26.1％，線粒體為17.4％；預(yù)測(cè)的HSPC016蛋白屬于PD053

7、992家族，含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其功能域與T2FA基因表達(dá)的蛋白具有最大同源性。T2FA蛋白又稱轉(zhuǎn)錄起始因子ⅡFα亞單位，具有促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄作用。綜合以上分析結(jié)果，HSPC016可能是細(xì)胞核內(nèi)某個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體的亞單位，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。為了對(duì)HSPC016基因功能作初步驗(yàn)證分析，我們依據(jù)HSPC016全長(zhǎng)mRNA序列設(shè)計(jì)合成了3條小片段RNA干擾序列，將小RNA干擾片段插入干擾載體psilencer-3.1-H1-hygro并轉(zhuǎn)染

8、具凝集性生長(zhǎng)特性的DPC。轉(zhuǎn)染至DPC內(nèi)的干擾載體利用細(xì)胞內(nèi)的酶系不斷合成干擾HSPC016基因表達(dá)的發(fā)夾狀小RNA干擾片段，使HSPC016基因在DPC內(nèi)的表達(dá)下降或消失。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HSPC016表達(dá)陰性的DPC生長(zhǎng)速度明顯減慢并失去凝集性生長(zhǎng)特性，細(xì)胞形態(tài)由卵圓形或橢圓形變?yōu)樗笮位蜷L(zhǎng)條狀的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。這一結(jié)果表明HSPC016對(duì)調(diào)節(jié)DPC生長(zhǎng)及其分化至關(guān)重要，是毛囊生長(zhǎng)期維持DPC處于功能狀態(tài)的重要基因之一。 綜上所