桔小實(shí)蠅保幼激素信號(hào)通路Met和Kr-h1基因功能初探.pdf

1、桔小實(shí)蠅 Bactrocera dorsalis(Hendel)隸屬雙翅目Diptera、實(shí)蠅科Tephritidae，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。由于極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)和擴(kuò)散入侵能力，桔小實(shí)蠅被多個(gè)國(guó)家和地區(qū)列為檢疫性害蟲(chóng)，對(duì)國(guó)際貿(mào)易造成了諸多限制；同時(shí)由于其寄主范圍廣、繁殖力強(qiáng)、造成的經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，因此該蟲(chóng)是果蔬上的危險(xiǎn)性害蟲(chóng)。桔小實(shí)蠅一生經(jīng)歷卵、幼蟲(chóng)、蛹、成蟲(chóng)四個(gè)發(fā)育階段，其成蟲(chóng)將卵產(chǎn)于果皮之下，幼蟲(chóng)孵化后取食果肉，造成果實(shí)脫落或失去

2、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。變態(tài)發(fā)育作為桔小實(shí)蠅重要的生理過(guò)程，具有重要的研究意義。在昆蟲(chóng)中，蛻皮激素和保幼激素協(xié)同作用，共同參與調(diào)控昆蟲(chóng)的蛻皮和變態(tài)發(fā)育。相對(duì)于蛻皮激素信號(hào)通路，保幼激素（Juvenile hormone,JH）分子作用機(jī)制還遠(yuǎn)未清楚。
　　本學(xué)位論文基于桔小實(shí)蠅基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)信息，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)，從桔小實(shí)蠅體內(nèi)克隆獲得了JH信號(hào)通路基因Met和Kr-h1的開(kāi)放閱讀框（ORF），并對(duì)其特征序列進(jìn)行了注釋；利用qPCR技

3、術(shù)解析了桔小實(shí)蠅Met和Kr-h1的時(shí)空表達(dá)模式，同時(shí)明確和記錄了外源激素（JH III和烯蟲(chóng)酯Methoprene）處理后桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)及蛹的應(yīng)激表達(dá)模式及其表型變化；在此基礎(chǔ)上，利用RNAi探索了Met和Kr-h1在桔小實(shí)蠅變態(tài)發(fā)育過(guò)程中的功能。研究結(jié)果不僅有助于了解昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理，還有利于尋找新的殺蟲(chóng)靶標(biāo)，為實(shí)蠅類害蟲(chóng)的持續(xù)防控提供新的思路和方法。主要研究結(jié)果如下：
　　1.桔小實(shí)蠅JH信號(hào)通路Met和Kr-h1基因的克隆與

4、序列分析
　　基于桔小實(shí)蠅基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，克隆獲得了JH信號(hào)通路Met和Kr-h1基因的ORF，并推導(dǎo)了其編碼的氨基酸序列。進(jìn)一步利用Scanprosite、NetNGlyc1.0、SignalP4.1以及TMHMM等生物信息學(xué)軟件分析了Met、Kr-h1基因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)的保守序列、跨膜結(jié)構(gòu)等潛在的生理功能。
　　2.桔小實(shí)蠅JH信號(hào)通路Met和Kr-h1基因的時(shí)空表達(dá)模式
　　2.1 桔小實(shí)蠅JH信號(hào)通路Met

5、和Kr-h1基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式
　　利用qPCR技術(shù)解析了JH信號(hào)通路Met、Kr-h1基因在桔小實(shí)蠅卵、幼蟲(chóng)、蛹及成蟲(chóng)1日齡的mRNA表達(dá)模式。結(jié)果表明，Met基因在桔小實(shí)蠅整個(gè)發(fā)育階段持續(xù)表達(dá)，但幼蟲(chóng)期的表達(dá)量明顯高于蛹期。幼蟲(chóng)期呈現(xiàn)不規(guī)律的波浪形起伏，在末齡期的第9日齡達(dá)到高峰，之后在蛹期持續(xù)低表達(dá)，推測(cè)該基因在桔小實(shí)蠅變態(tài)發(fā)育的過(guò)程中起著重要作用。
　　Kr-h1基因變化更為顯著，其在卵期有較高的相對(duì)表達(dá)量

6、，而在幼蟲(chóng)第3、4日齡有明顯的下調(diào)現(xiàn)象，在進(jìn)入3齡幼蟲(chóng)期的第5日齡開(kāi)始出現(xiàn)持續(xù)上調(diào)直至蛹期第1日齡，同樣在即將化蛹的幼蟲(chóng)第9日齡出現(xiàn)高峰。此外，Met、Kr-h1基因均在蛹-成蟲(chóng)的轉(zhuǎn)變過(guò)程中出現(xiàn)上調(diào)。Kr-h1基因在響應(yīng)桔小實(shí)蠅JH變化過(guò)程中發(fā)揮了極大的作用，是桔小實(shí)蠅變態(tài)發(fā)育的重要調(diào)控因子。
　　2.2 桔小實(shí)蠅JH信號(hào)通路Met和Kr-h1基因在幼蟲(chóng)不同組織的表達(dá)模式
　　利用qPCR技術(shù)解析了JH信號(hào)通路Met、Kr-

7、h1基因在桔小實(shí)蠅3齡幼蟲(chóng)脂肪體、馬氏管、中腸、氣管和表皮組織中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，2個(gè)基因均在桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)馬氏管中表達(dá)量最高，其次為脂肪體，而分別在幼蟲(chóng)氣管、中腸中表達(dá)量最低。
　　3.JH III和Methoprene對(duì)桔小實(shí)蠅Met和Kr-h1基因表達(dá)的影響
　　3.1 JH III和Methoprene對(duì)桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)Met和Kr-h1基因表達(dá)的影響
　　利用點(diǎn)滴法分別對(duì)桔小實(shí)蠅4日齡幼蟲(chóng)施用JH III和Me

8、thoprene。于處理后的6h、10h和24h，分別檢測(cè)桔小實(shí)蠅Met、Kr-h1基因的表達(dá)量。qPCR結(jié)果表明，兩種化合物均對(duì)Met基因無(wú)明顯的刺激作用；兩種激素處理后的24h，Kr-h1基因表達(dá)量均出現(xiàn)顯著性上調(diào)，最終導(dǎo)致幼蟲(chóng)在化蛹后形態(tài)上出現(xiàn)了介于幼蟲(chóng)和蛹之間的“中間形態(tài)”。此外，相對(duì)JH III，Kr-h1基因?qū)ethoprene更敏感。
　　3.2 JH III和Methoprene對(duì)桔小實(shí)蠅蛹Met和Kr-h1基因

9、表達(dá)的影響
　　利用點(diǎn)滴法分別對(duì)桔小實(shí)蠅初蛹（12 h）施用JH III和Methoprene。于處理后的1d、3d、5d、7d，分別檢測(cè)桔小實(shí)蠅Met和Kr-h1基因的表達(dá)量。qPCR結(jié)果表明，兩種激素處理對(duì)Met基因表達(dá)量無(wú)顯著影響；而Kr-h1基因表達(dá)水平在激素處理下顯著上調(diào)，其中Methoprene處理后的第7天，Kr-h1上調(diào)倍數(shù)達(dá)到79.5，最終導(dǎo)致桔小實(shí)蠅蛹由于不能正常羽化而死亡。
　　4.桔小實(shí)蠅Met和Kr

10、-h1基因的功能初探
　　分別將合成好的Met、Kr-h1基因dsRNA混入染料胭脂蟲(chóng)紅，對(duì)桔小實(shí)蠅4日齡幼蟲(chóng)進(jìn)行飼喂法RNA干擾，并通過(guò)qPCR技術(shù)檢測(cè)目的基因的沉默效果。結(jié)果表明，在iMet處理24h后，與對(duì)照相比，Met基因表達(dá)水平顯著下調(diào)56.2％，同時(shí)Kr-h1基因表達(dá)量也受到顯著抑制，分別下調(diào)了71.1%（24h）和42.3%（48h）；在iKr-h1處理24h和48h后，Kr-h1基因表達(dá)水平分別顯著下調(diào)78.9%和