肽聚糖識(shí)別蛋白PGRP-SC在家蠅腸道免疫中的功能分析.pdf

1、家蠅Musca domestica的整個(gè)生活史都與復(fù)雜的微生物環(huán)境有著緊密聯(lián)系，其高效的先天免疫防御機(jī)制能夠保護(hù)家蠅不受病原菌的侵害。但同時(shí)，微生物又在家蠅幼蟲發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，不恰當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)激可能對(duì)無(wú)害的共生菌群造成破壞，或?qū)C(jī)體造成損傷。因此家蠅需要嚴(yán)格控制免疫系統(tǒng)的強(qiáng)度，在維持共生菌與應(yīng)對(duì)病原體感染之間取得平衡。作為一種模式識(shí)別受體，肽聚糖識(shí)別蛋白(peptidoglycan recognition proteins, P

2、GRPs)在免疫系統(tǒng)應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)室前期在家蠅中克隆得到一種肽聚糖識(shí)別蛋白 PGRP-SC，該蛋白在家蠅幼蟲腸道中表達(dá)量最高，我們猜測(cè)家蠅PGRP-SC可能在腸道免疫中起調(diào)控作用。為驗(yàn)證這一假設(shè)，我們通過(guò)RNAi技術(shù)干擾家蠅幼蟲PGRP-SC基因表達(dá)，進(jìn)而對(duì)該肽聚糖識(shí)別蛋白在家蠅幼蟲腸道免疫中的功能進(jìn)行鑒定。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴使用注射法和投喂法兩種方式嘗試對(duì)家蠅幼蟲PGRP-SC基因進(jìn)行RN

3、A干擾：首先通過(guò)體外合成雙鏈RNA(double-strand RNA, dsRNA)并注射到家蠅1齡幼蟲體內(nèi)，利用qPCR技術(shù)檢測(cè)PGRP-SC基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，在注射48 h后干擾組幼蟲目的基因表達(dá)量出現(xiàn)極顯著下調(diào)，最大干擾效率為70.94％。接下來(lái)，我們對(duì)家蠅1齡幼蟲投喂表達(dá)dsRNA的大腸桿菌，并利用qPCR檢測(cè)PGRP-SC基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，在注射24 h后干擾組幼蟲目的基因表

4、達(dá)量出現(xiàn)顯著下調(diào)，在注射48 h后干擾組幼蟲目的基因表達(dá)量出現(xiàn)極顯著下調(diào)，最大干擾效率為53.95%。⑵通過(guò)投喂表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的大腸桿菌可以在熒光顯微鏡下監(jiān)測(cè)攝入的外源細(xì)菌在家蠅幼蟲腸道內(nèi)的時(shí)空動(dòng)態(tài)。分別對(duì)陰性對(duì)照組和干擾組完成投喂后，放置30 min再次在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)干擾組幼蟲腸道內(nèi)熒光明顯減弱，說(shuō)明攝入的大腸桿菌被幼蟲清除。⑶分別對(duì)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組以及

5、干擾組幼蟲腸道內(nèi)過(guò)氧化氫含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)各組數(shù)據(jù)之間沒有顯著性差異，推測(cè)在上述清除過(guò)程中不涉及過(guò)氧化氫合成的參與。⑷利用熒光定量PCR技術(shù)，分別對(duì)陰性對(duì)照組和干擾組幼蟲腸道內(nèi)attacin, diptericin, muscin和cecropin等抗菌肽基因的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，并發(fā)現(xiàn)干擾 PGRP-SC表達(dá)之后，4種抗菌肽基因表達(dá)均有不同程度的顯著上調(diào)，表明PGRP-SC在控制家蠅幼蟲腸道免疫敏感程度中起作用。干擾PGRP-SC基因