棉鈴蟲(chóng)中肽聚糖識(shí)別蛋白PGRP-C的基因克隆及表達(dá)模式.pdf

1、無(wú)脊椎動(dòng)物缺少獲得性免疫(adaptive immunity)，但是卻具有可以對(duì)病原微生物做出快速和有效應(yīng)答的先天性免疫系統(tǒng)(innate immunity)。先天免疫系統(tǒng)在啟動(dòng)免疫防御時(shí)首先通過(guò)一系列高度保守的模式識(shí)別受體識(shí)別病原體表面的相關(guān)分子模式進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)引起免疫反應(yīng)。肽聚糖識(shí)別蛋白(PGRP)是一種重要的模式識(shí)別受體，它可以識(shí)別微生物表面的肽聚糖(PGN)，在激活免疫調(diào)控途徑中行使著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，它可以參

2、與吞噬作用、黑化級(jí)聯(lián)反應(yīng)和抗菌肽產(chǎn)生等先天免疫反應(yīng)中。
　　 目前已在多種昆蟲(chóng)中都發(fā)現(xiàn)了PGRP，研究表明盡管這些PGRPs在結(jié)構(gòu)上具有一定的保守性，但是其功能和表達(dá)模式卻不盡相同，因此，要想全面深入的了解PGRP在昆蟲(chóng)先天免疫中的功能，可能還需要在更多類(lèi)型的昆蟲(chóng)中開(kāi)展PGRP研究。本實(shí)驗(yàn)以棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)為研究對(duì)象，克隆鑒定出一種肽聚糖識(shí)別蛋白，將其命名為HaPGRP－C，并初步研究了該基因在

3、先天性免疫中的表達(dá)模式和功能，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果可以分為以下幾方面：
　　 1、棉鈴蟲(chóng)肽聚糖識(shí)別蛋白基因HaPGRP-C的克隆以及序列分析：利用Smart PCR技術(shù)獲得了棉鈴蟲(chóng)一個(gè)PGRP基因的全長(zhǎng)序列，此基因具有一個(gè)完整的開(kāi)放讀碼框(ORF)，從起始密碼子12bp到終止密碼子650bp處，可以編碼212個(gè)氨基酸，其編碼的蛋白有一個(gè)PGRP結(jié)構(gòu)域和一個(gè)Ami結(jié)構(gòu)域，其中PGRP結(jié)構(gòu)域位于N端的第31個(gè)氨基酸到第173個(gè)氨基酸；而

4、且該蛋白還含有信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu)域；通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲(chóng)的PGRP與其他鱗翅目昆蟲(chóng)PGRP-C同源性最高，故將其命名為HaPGRP-C。
　　 2、HaPGRP-C的組織特異性表達(dá)分析：提取棉鈴蟲(chóng)的表皮、脂肪體、中腸和血細(xì)胞四種組織的總RNA，利用RT-PCR分析HaPGRP-C不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HaPGRP-C在除了表皮之外的其他三種組織中都有表達(dá)，而且脂肪體中表達(dá)量最大。
　　 3、微生物免疫刺激對(duì)H

5、aPGRP-C表達(dá)的影響：用大腸桿菌(革蘭氏陰性菌，G-)和金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽(yáng)性菌，G+)免疫刺激棉鈴蟲(chóng)后，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)脂肪體和血細(xì)胞中HaPGRP-C表達(dá)量變化。結(jié)果顯示：脂肪體中的HaPGRP-C的表達(dá)量在注射兩種細(xì)菌后的2h和6h無(wú)明顯變化，但是在12h后表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)；血細(xì)胞中HaPGRP-C的表達(dá)量在注射G+后2h出現(xiàn)顯著上調(diào)，但是6h和12h無(wú)變化，但是在注射G-后其表達(dá)量在12h出現(xiàn)顯著上調(diào)。這些結(jié)果表

6、明，HaPGRP-C可能參與了棉鈴蟲(chóng)先天性免疫的調(diào)控。
　　 4、注射激素對(duì)HaPGRP-C的影響：對(duì)棉鈴蟲(chóng)注射保幼激素類(lèi)似物(JHA)和蛻皮激素(20E)后同樣利用熒光定量PCR檢測(cè)HaPGRP-C在脂肪體和血細(xì)胞中表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示：不管在脂肪體中還是血細(xì)胞中HaPGRP-C在注射兩種激素后其表達(dá)量都無(wú)明顯變化，其表達(dá)不受兩種激素的調(diào)控。
　　 5、HaPGRP-C的原核表達(dá)：擴(kuò)增出HaPGRP-C的ORF區(qū)，將

7、其克隆到原核表達(dá)載體pET32a(+)中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，然后將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，將轉(zhuǎn)化后的菌液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，利用Ni－NTA親和柱層析的方法成功獲得重組蛋白。
　　 6、重組蛋白與細(xì)菌的凝集反應(yīng)：將一定量的革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌與重組蛋白混合，在顯微鏡下觀察細(xì)菌和重組蛋白的結(jié)合現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)HaPGRP-C與大腸桿菌基本沒(méi)有結(jié)合現(xiàn)象，但是與金黃色葡萄球菌的結(jié)合現(xiàn)象很明顯。
　　 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)克隆得到了棉鈴蟲(chóng)