棉鈴蟲CrylAc抗性相關(guān)鈣粘蛋白基因突變的鑒定與檢測.pdf

1、棉鈴蟲Helicoverpa armigera Hübner屬鱗翅目夜蛾科,是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲。曾經(jīng)在我國棉花上大面積暴發(fā),造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。20世紀(jì)80年代以來化學(xué)殺蟲劑的廣泛應(yīng)用,使棉鈴蟲抗藥性得到快速發(fā)展。棉鈴蟲對殺蟲劑的抗性,特別是對擬除蟲菊酯的抗性劇增是導(dǎo)致20世紀(jì)90年代初我國北方棉區(qū)棉鈴蟲大爆發(fā)的主要因素之一。隨著Bt棉在我國的大面積種植,棉鈴蟲的發(fā)生量得到了有效地控制。但Bt棉在整個(gè)生長發(fā)育期內(nèi)都表達(dá)Bt毒素,且在我

2、國種植已超過10年。棉鈴蟲種群如此長時(shí)間處于Bt毒素篩選壓力之下,對Bt毒素產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)日益加大。
　　 目前已有多個(gè)棉鈴蟲品系經(jīng)室內(nèi)篩選對Bt毒素產(chǎn)生了抗性,如果田間棉鈴蟲對Bt毒素產(chǎn)生抗性將影響B(tài)t棉的種植壽命。對棉鈴蟲抗性機(jī)理的研究將會(huì)為田間棉鈴蟲抗性治理提供重要依據(jù)。鈣粘蛋白是Bt毒素作用過程中的一個(gè)重要受體,鈣粘蛋白的變異將會(huì)導(dǎo)致害蟲對Bt毒素產(chǎn)生抗性,目前至少已有3種害蟲鈣粘蛋白的變異被證實(shí)與其對Bt毒素的抗性有關(guān)

3、。棉鈴蟲GYBT抗性品系鈣粘蛋白基因缺失突變導(dǎo)致其氨基酸在429位提前終止,產(chǎn)生截短蛋白,使Bt毒素失去特異性結(jié)合受體。
　　 本文對棉鈴蟲室內(nèi)抗性品系和田間種群CrylAc抗性相關(guān)的鈣粘蛋白基因突變進(jìn)行鑒定和檢測,評價(jià)鈣粘蛋白在抗性形成及Bt作用機(jī)理中的作用。研究結(jié)果不僅對于明確CrylAc毒殺棉鈴蟲的分子機(jī)理、進(jìn)而預(yù)測棉鈴蟲潛在的抗性機(jī)理具有重要意義,還有利于了解田間棉鈴蟲的抗性基因的發(fā)展?fàn)顩r,為田間棉鈴蟲的抗性監(jiān)測提供技術(shù)

4、支持,為棉鈴蟲對Bt棉花的抗性治理提供重要理論依據(jù)。
　　 一、棉鈴蟲室內(nèi)CrylAc抗性品系鈣粘蛋白基因突變的鑒定和檢測
　　 對室內(nèi)棉鈴蟲CrylAc抗、感品系鈣粘蛋白基因組DNA進(jìn)行克隆和測序,結(jié)果顯示室內(nèi)敏感品系GY鈣粘蛋白(cadherin,Ha_BtR)基因組DNA(GenBank登錄號為DQ523166)全長全長16.4 kb,編碼區(qū)含有34個(gè)外顯子、33個(gè)內(nèi)含子。棉鈴蟲抗性品系GYBT(對CrylAc的抗

5、性>500倍)鈣粘蛋白Ha_BtR r1等位基因(GenBank登錄號為DQ523167)共有8.9 kb.與Ha_BtR野生型s相比在第8外顯子和第25外顯子之間缺失大約8.8 kb。5’剪切位點(diǎn)位于第8外顯子末端,3’剪切位點(diǎn)位于第25外顯子前的內(nèi)含子處。融合區(qū)域由第8外顯子大部分(88 bp)、第25外顯子前內(nèi)含子部分(120 bp)及第25外顯子組成。這一缺失產(chǎn)生了提前終止密碼子(TAA),使抗性品系中鈣粘蛋白不能完整表達(dá),從而

6、導(dǎo)致抗性產(chǎn)生。針對r1等位基因建立了基于DNA的分子檢測方法,這將有利于監(jiān)測田間棉鈴蟲種群鈣粘蛋白基因r1等位基因的頻率。
　　 二、田間棉鈴蟲鈣粘蛋白基因突變的鑒定與檢測
　　 通過F1篩選法對2005年我國河南安陽田間棉鈴蟲種群及2009年河北廊坊田間種群與CrylAc抗性相關(guān)鈣粘蛋白基因突變進(jìn)行了篩選、鑒定。在采自2005年我國河南安陽田間棉鈴蟲種群中我們成功發(fā)現(xiàn)了與CrylAc抗性相關(guān)的鈣粘蛋白新的等位基因r2和

7、r3。r2和r3分別在Ha-BtR的第8外顯子的相同位置插入了逆轉(zhuǎn)座子(HaRT1)長末端重復(fù)(LTR)和完整的逆轉(zhuǎn)座子HaRT1。這導(dǎo)致了鈣粘蛋白截短,缺失跨膜區(qū)域和毒素結(jié)合區(qū)。這是首次在田間棉鈴蟲種群中發(fā)現(xiàn)與CrylAc抗性相關(guān)的鈣粘蛋白基因突變,表明鈣粘蛋白基因變異可能是田間棉鈴蟲抗性產(chǎn)生的重要途徑。本研究還表明,含這兩個(gè)抗性等位基因的棉鈴蟲幼蟲在Bt棉上能完成發(fā)育過程。鈣粘蛋白基因位點(diǎn)應(yīng)成為田間棉鈴蟲抗性檢測的重要靶標(biāo)基因之一。

8、
　　 同樣,通過F1篩選法對2009年河北廊坊地區(qū)棉鈴蟲對CrylAc的抗性進(jìn)行篩查,選出候選單對10對,可疑候選單對4個(gè)。對候選單對系F1代抗性個(gè)體中來自田間親本的鈣粘蛋白基因全長cDNA進(jìn)行克隆、測序,發(fā)現(xiàn)了5個(gè)新的鈣粘蛋白基因突變類型。與敏感品系鈣粘蛋白基因相比:117＃單對系田間親本鈣粘蛋白基因發(fā)生插入突變導(dǎo)致在氨基酸754-755間插入30個(gè)氨基酸或在氨基酸751處終止；239＃在堿基4393-5097位缺失705

9、bp,導(dǎo)致EC11-CYT處235個(gè)氨基酸的缺失；234＃發(fā)生可變剪接,在堿基1194-2752之間缺失1530 bp,導(dǎo)致EC2-6缺失；256＃在堿基2403-1414位缺失導(dǎo)致4個(gè)氨基酸缺失(YTIT,802-805位)；124＃在堿基4825-4989間缺失165bp,導(dǎo)致在氨基酸1609-1663位間55個(gè)氨基酸缺失(CYT部分)。這些突變體的發(fā)現(xiàn)表明,與CrylAc抗性相關(guān)的鈣粘蛋白基因突變在田間種群中具有多樣性,田間棉鈴蟲

10、鈣粘蛋白不同形式的變異均可能導(dǎo)致抗性的產(chǎn)生,這將增加分子檢測鈣粘蛋白變異基因頻率進(jìn)而預(yù)測抗性發(fā)展?fàn)顩r的難度。
　　 三、棉鈴蟲鈣粘蛋白近等基因系的構(gòu)建和交互抗性
　　 通過GYBT品系與SCD品系雜交后經(jīng)多次回交并輔助分子標(biāo)記篩選將等位基因r1植入SCD品系建立近等基因系SCD-r1。對棉鈴蟲鈣粘蛋白近等基因系SCD與SCD-r1的正反交分析表明SCD-r1對CrylAc的抗性是完全隱性、常染色體遺傳?？剐云废礢CD-r

11、1對CrylAc的抗性為高水平抗性(>430倍)；對CrylAa、CrylAb有中等水平的交互抗性,對Cry2Aa和Cry2Ab2沒有交互抗性。原毒素CrylAcPro和CrylAbPro分別比胰蛋白酶活化毒素CrylAc和CrylAb對SCD—r1毒力效果好,SCD—r1品系對原毒素CrylAcPro和CrylAbPro的抗性明顯低于對胰蛋白酶活化毒素CrylAc和CrylAb的抗性。修改毒素CrylAcMod和CrylAbMod分別

12、比胰蛋白酶活化毒素CrylAc和CrylAb對SCD—r1毒力效果好,CrylAcMod和CrylAbMod都能顯著克服棉鈴蟲對CrylAc和CrylAb的抗性。這表明鈣粘蛋白在與不同毒素及同一毒素不同形式存在不同的相互作用,對Bt毒素進(jìn)行人工修飾能夠克服基于鈣粘蛋白基因變異產(chǎn)生的抗性,修飾的Bt毒素基因可能成為轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的候選基因。
　　 四、我國田間棉鈴蟲對CrylAc的敏感性監(jiān)測
　　 用毒素涂表法對我國200

13、6-2008年主要棉區(qū)的棉鈴蟲對CrylAc的敏感性進(jìn)行了監(jiān)測。2006-2008年監(jiān)測的12個(gè)田間種群對CrylAc敏感性變異小于6倍。采自黃河流域棉區(qū)的10個(gè)棉鈴蟲田間種群對CrylAc活化毒素的敏感性(LC50:0.063～0.162μgcm-2)略低于采自新疆棉區(qū)的2個(gè)田間種群(LC50:0.0274～0.049μg cm-2)。盡管這幾年我國主要棉區(qū)棉鈴蟲對CrylAc的敏感性沒有發(fā)生明顯變化,但是棉鈴蟲Bt抗性的檢測工作必須