PGRP-LB和PGRP-SB基因在橘小實蠅免疫及腸道微生物調(diào)控中的作用研究.pdf

1、橘小實蠅Bactrocera dorsalis(Hendel)是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，主要以幼蟲潛食為害。橘小實蠅的寄主十分廣泛，可危害柑桔、瓜類等多種水果、蔬菜和花卉。腸道微生物與昆蟲本身密切相關，影響著宿主很多生理功能，如營養(yǎng)代謝、免疫等方面。本研究采用RT-PCR和RACE技術克隆獲得基因PGRP-LB和PGRP-SB的ORF框序列，并通過注射和喂食大腸桿菌Escherichia coli研究橘小實蠅上述基因?qū)l件致病菌的免疫響應;

2、通過RNA干擾技術沉默基因PGRP-LB和PGRP-S，分析橘小實蠅的免疫響應及腸道微生物群落的變化，闡述這些基因在橘小實蠅免疫和腸道微生物穩(wěn)態(tài)維持中的作用，以期為橘小實蠅的綜合防治提供一種全新的防控思路和作用靶標。
　　1 PGRP-LB和PGRP-SB基因的克隆與表達模式
　　從NCBI獲得橘小實蠅PGRP-LB基因ORF框的核苷酸序列長度為738bp，成功克隆到橘小實蠅PGRP-S基因ORF框的核苷酸序列，其長度為55

3、8bp。序列分析表明兩個基因均與地中海實蠅相應基因序列的同源性最高，分別為86％和91％。表達模式結果表明PGRP-LB基因在橘小實蠅成蟲中腸中表達量最高，其次在成蟲脂肪體中表達量也較高，PGRP-SB基因主要在三齡幼蟲和性成熟成蟲脂肪體中表達。
　　2 PGRP-LB和PGRP-SB基因?qū)l件致病菌感染的免疫響應
　　通過對橘小實蠅注射或喂食感染條件致病菌E.coli后，Imd信號通路中的抗菌肽基因Diptericin的表

4、達量顯著增加，注射E.coli后6h反應最強烈，Diptericin的表達量上調(diào)了6.40倍，喂食E.coli后12h反應最強烈，Diptericin的表達量上調(diào)了4.52倍;同時PGRP-LB和PGRP-SB基因表達水平明顯上調(diào)，注射菌液后6h PGRP-LB基因表達量上調(diào)2.97倍，注射菌液后24h PGRP-SB基因表達量上調(diào)1.61倍;喂食菌液后12h PGRP-LB和PGRP-S基因反應均最強烈，表達量分別比對照組上調(diào)了54.

5、32％和30.26％。但注射感染比喂食感染引起的體液免疫反應更為強烈迅速。這些結果表明E.coli能啟動橘小實蠅系統(tǒng)及腸道Imd信號通路的免疫反應，且抗菌肽基因Diptericin與PGRP-LB和PGRP-SB基因在免疫防御過程中起著重要作用。
　　3 PGRP-LB和PGRP-SB基因?qū)﹂傩嵪壝庖叻磻挠绊?br>　　通過干擾PGRP-LB和PGRP-SB基因后注射或喂食E.coli研究PGRP-LB和PGRP-SB基因在橘

6、小實蠅免疫中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，沉默PGRP-LB和PGRP-SB基因的橘小實蠅在注射或喂食感染E.coli后，其抗菌肽基因Diptericin的表達量與對照組相比均顯著上調(diào)，免疫反應增強且免疫反應持續(xù)時間增長。以上結果說明PGRP-LB和PGRP-SB基因能抑制橘小實蠅腸道免疫系統(tǒng)過激的免疫反應，起到免疫負調(diào)控作用。
　　4 PGRP-LB和PGRP-SB基因沉默對橘小實蠅腸道微生物群落的影響
　　通過PGRP-LB和PGR

7、P-SB基因的RNAi，研究PGRP-LB和PGRP-SB基因在橘小實蠅腸道內(nèi)共生菌群落穩(wěn)態(tài)維持中的作用。Real-time PCR結果表明，干擾后5天內(nèi)PGRP-LB和PGRP-S基因表達量都處于下調(diào)狀態(tài)，第15天時基因表達量恢復正常，與對照組表達量無顯著差異。同時分別于第5、15、20天檢測腸道微生物群落變化，結果表明PGRP-LB基因干擾后第5天腸道內(nèi)總細菌數(shù)量、γ-變形菌門(γ-Proteobacteria)、放線菌門(Acti

8、nobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)細菌分別下調(diào)18.78％、56.67％、61.98％和67.46％;PGRP-SB基因干擾后第5天腸道內(nèi)總細菌數(shù)量、α-變形菌門(α-Proteobacteria)、γ-變形菌門(γ-Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)分別下調(diào)31.73％、40.41％、44.64％、50

9、.26％、52.19％和70.18％。PGRP-LB基因干擾后第15天腸道內(nèi)總細菌數(shù)量、α-變形菌門(α-Proteobacteria)、γ-變形菌門(γ-Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)細菌分別上調(diào)2.16倍、1.04倍、1.65倍、0.38倍、2.70倍、0.84倍。PGRP-SB基因干擾后第15天腸道內(nèi)總細菌數(shù)量和放線

10、菌門(Actinobacteria)細菌無顯著變化，α-變形菌門(α-Proteobacteria)、γ-變形菌門(γ-Proteobacteria)細菌分別上調(diào)53.77％和60.48％，擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門（Firmicutes）細菌分別下調(diào)14.89％和63.60％。PGRP-LB基因干擾后第20天腸道內(nèi)總的細菌和五個門的細菌數(shù)量均恢復到正常水平。PGRP-SB基因干擾后第20天腸道內(nèi)總的細菌和γ-變形