小菜蛾免疫Bt動力學(xué)的DGE分析及其PGRP-LB基因的克隆.pdf

1、肽聚糖識別蛋白（PGRPs）是昆蟲免疫系統(tǒng)中一類重要的模式識別受體，在識別入侵病原物及激活免疫信號通路(Toll和 Imd)中發(fā)揮重要作用。為探討PGRPs基因在重要農(nóng)業(yè)害蟲小菜蛾（Plutella xylostella）免疫識別高致病性蘇云金芽孢桿菌HD73（Bt）等病原微生物中的作用，本研究在測定 Bt侵染小菜蛾不同時(shí)間后的數(shù)字基因表達(dá)譜（DGE）基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)分析了小菜蛾免疫防御Bt侵染的相關(guān)基因，探討了小菜蛾免疫防御Bt

2、侵染的動力學(xué)分子機(jī)制；運(yùn)用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆了 PGRP-LB1和 PGRP-LB2基因的cDNA全長序列，在此基礎(chǔ)上運(yùn)用qRT-PCR（Quantitative Real-time PCR）技術(shù)研究了Bt侵染后PGRP-LB1和PGRP-LB2基因的時(shí)空表達(dá)模式；運(yùn)用飼喂法 RNAi技術(shù)對 PGRP-LB1和 PGRP-LB2免疫識別Bt的侵染進(jìn)行了初步的探索。主要研究結(jié)果如下：
　　為探討小菜蛾免疫防御Bt侵染的

3、動態(tài)學(xué)機(jī)制。本研究基于RNA-Seq技術(shù)測定了Bt侵染小菜蛾不同時(shí)間（6h、12 h、18h、24h和36 h）后的DGE。以小菜蛾基因組作為背景，比較了分析了Bt侵染小菜蛾6h、12 h、18h、24h和36 h后的差異表達(dá)基因。DGE測定結(jié)果顯示：Bt處理小菜蛾6h時(shí)，獲得2573個(gè)差異表達(dá)基因，其中747個(gè)上調(diào)，1826個(gè)下調(diào)；免疫相關(guān)基因249個(gè)，其中5個(gè)上調(diào)，97個(gè)下調(diào)。Bt處理12h時(shí)，獲得1582個(gè)差異表達(dá)基因，其中119

4、0個(gè)上調(diào)，392個(gè)下調(diào)；免疫相關(guān)基因249個(gè)，其中8個(gè)上調(diào)，37個(gè)下調(diào)。Bt處理18h時(shí)，獲得1036個(gè)差異表達(dá)基因，其中568個(gè)上調(diào)，468個(gè)下調(diào)；免疫相關(guān)基因249個(gè)，其中7個(gè)上調(diào)，51個(gè)下調(diào)。Bt處理24h時(shí)，獲得3404個(gè)差異表達(dá)基因，其中2746個(gè)上調(diào)，658個(gè)下調(diào)；免疫相關(guān)基因249個(gè)，其中30個(gè)上調(diào)，49個(gè)下調(diào)。Bt處理36h時(shí)，獲得4396個(gè)差異表達(dá)基因，其中3877個(gè)上調(diào)，519個(gè)下調(diào)；免疫相關(guān)基因249個(gè)，其中53個(gè)

5、上調(diào)，53個(gè)下調(diào)。
　　在這些差異表達(dá)基因中，PGRP家族、Spatzle和Toll家族基因表達(dá)上調(diào)，表達(dá)差異顯著；Cactus、Imd和relish下調(diào)表達(dá)差異顯著；抗菌肽基因中，只有Lysozyme（Lys）家族表達(dá)上調(diào)，其次過氧化為酶和超氧化物歧化酶表達(dá)上調(diào)。以上結(jié)果表明PGRP家族在識別Bt侵染及啟動Toll信號通路，并結(jié)合Lys家族協(xié)同免疫防御Bt的侵染。Bt侵染誘導(dǎo)了Toll基因的表達(dá)上調(diào)以及Imd基因的表達(dá)下調(diào)，表明

6、小菜蛾免疫防御Bt侵染不僅僅是通過Toll的上調(diào)，還有可能是通過Imd、relish通路的下調(diào)來增強(qiáng)免疫防御能力。其次9個(gè)PGRPs中，根據(jù)不同處理的RPKM值找到具有明顯差異的兩個(gè)PGRP基因，即PGRP-LB1和PGRP-LB2，與PBS處理6h相比較，PGRP-LB1在6h和42h各有一個(gè)小高峰為69倍和35倍，PGRP-LB2在6h和42h各有一個(gè)小高峰為309倍和513倍,表明PGRP-LB1和PGRP-LB2在小菜蛾免疫識別

7、Bt過程中具有重要作用。
　　為進(jìn)一步探討PGRP-LB1和PGRP-LB2的功能。根據(jù)PGRP-LB1和PGRP-LB2 Unigene序列設(shè)計(jì)引物，通過 RT-PCR結(jié)合 RACE方法克隆了小菜蛾 PGRP-LB1和PGRP-LB2這兩個(gè)基因的cDNA全長序列，其中PxPGRP-LB1基因全長為937bp，完整開放閱讀框?yàn)?94bp，可編碼197個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測成熟肽分子量為21.197kDa，等電點(diǎn)為5.48。PxPGRP

8、-LB2基因全長為772bp，完整開放閱讀框?yàn)?12bp，可編碼204個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測成熟肽分子量為22.114 kDa，等電點(diǎn)為7.40，前18個(gè)氨基酸具有分泌蛋白信號肽的特征，推測為一種分泌蛋白。序列比對及進(jìn)化關(guān)系分析表明，PxPGRP-LB1和PxPGRP-LB2隸屬于PGRP-LB家族。
　　為探討PxPGRP-LB1和PxPGRP-LB2基因的表達(dá)模式和對病原微生物誘導(dǎo)后表達(dá)的敏感度。qRT-PCR檢測結(jié)果表明PxPG

9、RP-LB1和PxPGRP-LB2在小菜蛾mRNA水平上具有不同程度的上調(diào)表達(dá)，且PGRP-LB1在誘導(dǎo)6h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高峰，之后一直減少，在18h有另一個(gè)小高峰；對于PGRP-LB2在18h表達(dá)量達(dá)到最高峰。組織特異性檢測結(jié)果表明，體壁中，均在48h表達(dá)量達(dá)到最高峰；在血細(xì)胞中也都在48h有一誘導(dǎo)高峰；在中腸中，對于PGRP-LB1基因在18h達(dá)到誘導(dǎo)高峰，而PGRP-LB2在48h誘導(dǎo)量才達(dá)到最大。在脂肪體中，18h達(dá)到表達(dá)量最大

10、，而 PGRP-LB2在6h表達(dá)量達(dá)到最大；在馬氏管中，兩個(gè)基因均在48h表達(dá)量達(dá)到最大，表明兩個(gè)基因表達(dá)存在組織差異性。
　　為探討PxPGRP-LB1和PxPGRP-LB2在小菜蛾免疫識別Bt過程中的作用。本研究成功構(gòu)建了L4440-GFP、L4440-PGRP-LB1和L4440-PGRP-LB2表達(dá)質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌HT115中，將1×107CFU/ml的表達(dá)菌株飼喂小菜蛾二齡幼蟲，24h之后，飼喂1×105C

11、FU/ml的Bt菌，結(jié)果表明小菜蛾死亡率升高，表明通過飼喂可以沉默PGRP-LB基因的表達(dá)。
　　綜上所述，運(yùn)用DGE明確了小菜蛾免疫Bt的相關(guān)基因及其表達(dá)的動力學(xué)，為研究小菜蛾與Bt侵染的互作機(jī)制提供了靶標(biāo)免疫基因。成功克隆了小菜蛾免疫Bt的關(guān)鍵基因PxPGRP-LB1和PxPGRP-LB2，不僅補(bǔ)充了PGRP家族成員；在此基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了飼喂小菜蛾的細(xì)菌干擾系統(tǒng)，為研究小菜蛾相關(guān)免疫基因的功能提供了新的干擾技術(shù)，也為基于小菜蛾