小菜蛾顆粒體病毒Px26基因功能的初步分析.pdf

1、桿狀病毒是一類節(jié)肢動物特異的環(huán)狀雙鏈DNA病毒，該病毒的包膜蛋白是病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白，這一結(jié)構(gòu)蛋白對于介導(dǎo)病毒侵入起重要作用，同時還可能影響病毒的宿主范圍。小菜蛾顆粒體病毒（Plutella xylostella Granulovirus，PlxyGV）是小菜蛾的主要致病病毒，農(nóng)業(yè)上主要用于生物防治殺蟲劑。同其他Ⅱ組NPV及黃地老虎顆粒體病毒（Agrotis segetum Granulovirus，AgseGV）類似，PlxyGV的基

2、因組中也沒有g(shù)p64的同源基因，但發(fā)現(xiàn)其orf26（Px26）的預(yù)期編碼產(chǎn)物與AgseGV的F蛋白（AgseF）同源，二者具有較高序列相似度。最近有研究報道顯示，AgseGV f基因能夠功能性替代苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）的gp64基因，而且具有低pH誘導(dǎo)的膜融合功能。 為了試圖探討Px26基因的功能屬性及其預(yù)期編碼產(chǎn)物在轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞內(nèi)的定位，本文首先通過構(gòu)建含有egfp（質(zhì)粒pIE-egfp）、Px26（質(zhì)粒p

3、IE-Px26）和Px26-egfp（質(zhì)粒pIE-Px26-egfp）融合基因的瞬時表達(dá)質(zhì)粒及對照質(zhì)粒pLd130-egfp對多種昆蟲傳代細(xì)胞系進行轉(zhuǎn)染。實驗結(jié)果表明：當(dāng)用質(zhì)粒pIE-egfp轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)綠色熒光都布滿整個細(xì)胞，將pH由6.0降至5.0時無多核細(xì)胞形成；而用質(zhì)粒pLd130-egfp轉(zhuǎn)染細(xì)胞后部分細(xì)胞充滿熒光，部分細(xì)胞只在其膜上有熒光分布，將培養(yǎng)基pH由6.0降至5.0時，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞出現(xiàn)多核細(xì)胞或合胞體；用pIE-

4、Px26-egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞pH由6.0到5.0時，熒光有的分布于膜上，有的分布于整個細(xì)胞，但無合胞體出現(xiàn)。此外，對比pIE-Px26-egfp、pIE-Px26與pLd130-egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，進一步說明Px26預(yù)期編碼產(chǎn)物不能促使轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞膜融合。然而，用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Bm-21E-HNU5和SL-1細(xì)胞時的現(xiàn)象相同，由于LD130-EGFP及Px26-EGFP這兩種融合蛋白在這兩種細(xì)胞系中的表達(dá)量都較低，因而，在低pH

5、誘導(dǎo)下都未發(fā)現(xiàn)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞膜有融合的現(xiàn)象。此外，為了排除pH對實驗造成的影響，實驗時還分別用不同pH培養(yǎng)基作用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（pH3.0或4.0； pH7.0或7.2），發(fā)現(xiàn)用質(zhì)粒pIE-Px26-egfp及pIE-Px26轉(zhuǎn)染的細(xì)胞仍無多核細(xì)胞現(xiàn)象出現(xiàn)，而且這種不融合現(xiàn)象與轉(zhuǎn)染細(xì)胞的類型及培養(yǎng)基的pH無關(guān)。 其次，通過利用Lamda-Red重組系統(tǒng)對AcMNPV的Bacmid.進行g(shù)p64基因敲除，為下一步回復(fù)敲除研究未知膜

6、融合基因的功能打下基礎(chǔ)。Lamda-Red重組系統(tǒng)最初主要被用于大腸桿菌基因組的研究。近年來隨著桿狀病毒穿梭載體的開發(fā)成功，使得該重組系統(tǒng)已成為研究桿狀病毒基因功能的有力工具。本文的第二部分則是用Lamda-Red重組系統(tǒng)對AcMNPV的Bacmid進行g(shù)p64基因敲除，獲得缺失該基因的重組Bacmid，通過轉(zhuǎn)染-感染實驗驗證，初步構(gòu)建一表達(dá)EGFP的重組病毒。為深入研究Px26基因及其它外源基因回復(fù)敲除鑒定基因功能奠定基礎(chǔ)，該項工作正