草莓鑲脈病毒致病相關(guān)基因功能分析.pdf

1、病毒侵染寄主后,往往會(huì)引起寄主出現(xiàn)相應(yīng)的癥狀表型,這種表型的出現(xiàn)往往與病毒編碼的致病蛋白有關(guān)。研究證明草莓鑲脈病毒(Strawberryveinbandingvirus,SVBV)編碼的P6蛋白是一個(gè)弱RNA沉默抑制子,在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步開展了SVBV編碼的P6蛋白以及其他蛋白的致病性研究。本課題不僅鑒定了SVBV單個(gè)編碼蛋白的致病性,還研究了SVBV編碼蛋白間的互作情況。另外,初步探究了P6蛋白是否影響植物體抗病相關(guān)基因06G的表達(dá),

2、為在分子水平上闡明SVBV的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
　　1.SVBV致病相關(guān)基因的克隆及載體構(gòu)建
　　以SVBV美國(guó)分離物全長(zhǎng)克隆(pSVBV-E3)為模板,用特異性引物對(duì)分別擴(kuò)增P1、P2、P4、P6基因和P6移碼突變基因,插入病毒載體pGR106,獲得侵染性克隆重組載體pGR-P1-US、pGR-P2-US、pGR-P4-US、pGR-P6-US和pGR-△P6-US。另將P6基因構(gòu)建到雙元表達(dá)載體pCAM2300上,得到

3、重組表達(dá)載體pCAM-P6-US。各重組載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。
　　2.瞬時(shí)浸潤(rùn)驗(yàn)證SVBV致病相關(guān)蛋白
　　含pGR-P1-US、pGR-P2-US、pGR-P4-US、pGR-P6-US、pGR-△P6-US和空載體pGR106的農(nóng)桿菌分別浸潤(rùn)本氏煙葉片。癥狀觀察發(fā)現(xiàn),pGR-P1-US浸潤(rùn)的系統(tǒng)葉片引起的輕花葉癥狀與空載體pGR106癥狀相似;pGR-P2-US浸潤(rùn)15d后,系統(tǒng)葉表現(xiàn)出輕花葉癥狀,但浸潤(rùn)20

4、d后也表現(xiàn)出重度花葉癥狀;pGR-P4-US浸潤(rùn)的系統(tǒng)葉片同樣產(chǎn)生重度花葉癥狀,與浸潤(rùn)pGR-P6-US相似。pGR-P6-US浸潤(rùn)的系統(tǒng)葉片表現(xiàn)重度花葉癥狀,pGR-△P6-US和pGR106浸潤(rùn)的系統(tǒng)葉片只表現(xiàn)出輕花葉癥狀,ELISA檢測(cè)表明,pGR-P6-US浸潤(rùn)的系統(tǒng)葉片中能夠檢測(cè)到P6蛋白的表達(dá)。研究表明,SVBV編碼的P2、P4和P6蛋白可能均與癥狀表型密切相關(guān)。
　　3.SVBV編碼蛋白的互作對(duì)癥狀表型的影響

5、　　含重組質(zhì)粒pGR-P1-US、pGR-P2-US、pGR-P4-US的農(nóng)桿菌分別和含重組質(zhì)粒pGR-P6-US的農(nóng)桿菌共浸潤(rùn)本氏煙葉片。癥狀觀察發(fā)現(xiàn),pGR-P1-US和pGR-P6-US共浸潤(rùn)的系統(tǒng)葉片出現(xiàn)了與單獨(dú)浸潤(rùn)pGR-P6-US相似的重度花葉癥狀;pGR-P2-US和pGR-P6-US共浸潤(rùn)的系統(tǒng)葉片出現(xiàn)了與單獨(dú)浸潤(rùn)pGR-P6-US相似的重度花葉癥狀并延遲了顯癥時(shí)間;pGR-P4-US和pGR-P6-US共浸潤(rùn)的系統(tǒng)葉片

6、出現(xiàn)了重度花葉癥狀,頂部葉片皺縮、下卷,甚至出現(xiàn)壞死和整個(gè)植株生長(zhǎng)停滯。共浸潤(rùn)研究表明,P1蛋白不能促進(jìn)P6蛋白的過表達(dá),進(jìn)一步說(shuō)明P1蛋白與癥狀表型無(wú)關(guān);P2蛋白與P6蛋白在寄主體內(nèi)的互作延遲了顯癥時(shí)間,說(shuō)明P2蛋白可能對(duì)P6蛋白有一定的負(fù)調(diào)控作用;P4蛋白和P6蛋白的互作顯著加重了癥狀,表現(xiàn)出極強(qiáng)的致病性,說(shuō)明P4蛋白和P6蛋白之間可能具有一定的協(xié)生作用。
　　4.SVBVP6基因在本氏煙中穩(wěn)定表達(dá)的癥狀表型
　　將構(gòu)建

7、的重組質(zhì)粒pCAM-P6-US轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105,葉盤法轉(zhuǎn)化本氏煙?？剐院Y選及提取轉(zhuǎn)基因煙草總DNA,特異性引物PCR擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn),目的基因已成功整合進(jìn)本氏煙基因組中。癥狀觀察發(fā)現(xiàn),P6轉(zhuǎn)基因本氏煙沒有表現(xiàn)出特殊的癥狀表型。
　　5.P6與植物抗病性相關(guān)基因06G的互作
　　構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAM-P6-US、pCAM-2b和pCAM-HC-Pro,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌分別浸潤(rùn)本氏煙,6d后采集浸潤(rùn)葉片提取總RNA,Real-Time