草莓鑲脈病毒運動蛋白功能域分析及其胞內(nèi)運動機制研究.pdf

1、植物病毒侵入寄主，先在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，經(jīng)過胞內(nèi)、胞間的橫向運輸和維管束長距離徑向運輸，才能成功系統(tǒng)侵染寄主。這個過程涉及病毒自身特異性編碼的運動蛋白（movement protein, MP）。研究表明，草莓鑲脈病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）編碼的P1蛋白是一個運動蛋白，但是病毒進(jìn)入寄主體內(nèi)如何進(jìn)行胞內(nèi)、胞間和長距離運動機制尚不明確。本課題分析和鑒定了MP蛋白的功能域，并研究了SVBV MP

2、蛋白的胞內(nèi)運動機制，為進(jìn)一步研究SVBV MP蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　1. SVBV MP蛋白功能域的預(yù)測
　　利用軟件分析了SVBV MP蛋白的功能域，發(fā)現(xiàn)119 aa-233 aa為運動相關(guān)的關(guān)鍵區(qū)域，而30 aa-55 aa和283 aa-329aa是蛋白互作的關(guān)鍵區(qū)域。
　　2. SVBV MP蛋白運動相關(guān)功能域的鑒定
　　為了確定MP蛋白的功能域，構(gòu)建了3個缺失突變體pCV-MP?30-55-YFP

3、、pCV-MP?119-233-YFP、pCV-MP?283-329-YFP。
　　（1）MP缺失突變體的亞細(xì)胞定位含pCV-MP-YFP、pCV-MP?30-55-YFP、pCV-MP?119-233-YFP、pCV-MP?283-329-YFP和pCV-YFP的農(nóng)桿菌浸潤本氏煙，發(fā)現(xiàn) MP及其突變體 MP?30-55和 MP?283-329均能夠定位在細(xì)胞壁上，而突變體MP?119-233定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上。說明 MP蛋白

4、119 aa-233 aa區(qū)域是決定MP運動相關(guān)的功能域。
　?。?） MP缺失突變體的運動回補功能含 pPVX-?P25-GFP、pPVX-?P25-GFP+pBin438、pPVX-?P25-GFP+pBin-MP?30-55、pPVX-?P25-GFP+pBin-MP?119-233和 pPVX-?P25-GFP+pBin-MP?283-329的農(nóng)桿菌浸潤本氏煙，發(fā)現(xiàn)MP、MP?30-55和MP?283-329能夠互補運動缺

5、陷型PVX載體，綠色熒光能從單個細(xì)胞向外擴散至3-4個細(xì)胞乃至整個葉片。表明MP蛋白119 aa-233 aa是決定MP運動相關(guān)的功能域。
　　3. SVBV MP蛋白與P4蛋白互作相關(guān)功能域的鑒定
　?。?）酵母雙雜交驗證互作功能域質(zhì)粒 pGBK-MP?30-55+pGAD-P4、pGBK-P4+pGAD-MP?30-55、pGBK-MP?119-233+pGAD-P4、pGBK-P4+pGAD-MP?119-233、pG

6、BK-MP?283-329+pGAD-P4和pGBK-P4+pGAD-MP?283-329分別共轉(zhuǎn)化酵母，發(fā)現(xiàn)pGBK-P4+pGAD-MP?119-233共轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞能夠在選擇培養(yǎng)基上生長。表明MP30 aa-55 aa和283 aa-329 aa是與P4蛋白互作的關(guān)鍵功能域。
　?。?）雙分子熒光互補驗證互作功能域含pCV-nYFP-MP?30-55+pCV-cYFP-P4、pCV-nYFP-P4+pCV-cYFP-MP?

7、30-55、pCV-nYFP-MP?119-233+pCV-cYFP-P4、pCV-nYFP-P4+pCV-cYFP-MP?119-233、 pCV-nYFP-MP?283-329+pCV-cYFP-P4和pCV-nYFP-P4+pCV-cYFP-MP?283-329的農(nóng)桿菌分別共浸潤本氏煙，發(fā)現(xiàn)浸潤pCV-nYFP-MP?119-233+pCV-cYFP-P4農(nóng)桿菌的本氏煙表皮細(xì)胞中出現(xiàn)黃色熒光，說明SVBV MP30 aa-55 a

8、a和283 aa-329 aa是與P4蛋白互作的關(guān)鍵功能域。
　　4. SVBV MP蛋白的胞內(nèi)定位
　　含質(zhì)粒pCV-MP-YFP的農(nóng)桿菌浸潤本氏煙，發(fā)現(xiàn)MP蛋白形成的點顆狀物存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)中，而且MP形成的點顆狀物在細(xì)胞質(zhì)中能夠沿著某種軌跡移動，最終定位于胞間連絲（PD）。表明 MP蛋白形成的點顆狀物在細(xì)胞質(zhì)中沿著某種軌跡靶向PD。
　　5. SVBV MP蛋白與微管的共定位
　　含質(zhì)粒pCV-MP-Y

9、FP和pCV-MT-RFP的農(nóng)桿菌共浸潤本氏煙，發(fā)現(xiàn)MP蛋白能夠和微管（MT）共定位。用微管抑制劑處理本氏煙表皮細(xì)胞后，再浸潤含質(zhì)粒pCV-MP-YFP和pCV-MP-YFP+MT-RFP的農(nóng)桿菌，發(fā)現(xiàn)MP蛋白任然能夠和微管（MT）共定位，只是靶向胞間連絲（PD）的MP蛋白數(shù)量明顯減少。表明SVBV MP蛋白靶向PD與細(xì)胞骨架微管的結(jié)構(gòu)有關(guān)，但是微管不是MP蛋白胞內(nèi)運輸?shù)奈ㄒ煌緩健?br>　　6. SVBV MP蛋白與微絲的共定位

10、>　　含質(zhì)粒 pCV-MP-YFP和 pCAM-ABD2-GFP的農(nóng)桿菌共浸潤本氏煙，發(fā)現(xiàn)MP蛋白能夠和微絲（ABD2）共定位，說明SVBV MP蛋白靶向PD與細(xì)胞骨架微絲有關(guān)。
　　7. SVBV MP蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的共定位
　　含質(zhì)粒pCV-MP-YFP和pCV-ER-RFP的農(nóng)桿菌浸潤本氏煙，發(fā)現(xiàn)MP蛋白能夠和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）共定位，說明SVBV MP蛋白靶向PD與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關(guān)。
　　8. SVBV編碼蛋白間的互作

11、r>　　質(zhì)粒 pGBK-P3+pGAD-P4和 pGBK-P4+pGAD-P3分別共轉(zhuǎn)化酵母，發(fā)現(xiàn)SVBV P3與P4蛋白互作。含pCV-nYFP-P2+pCV-cYFP-P3、pCV-nYFP-P3+pCV-cYFP-P2、 pCV-nYFP-P3+pCV-cYFP-P4和pCV-nYFP-P4+pCV-cYFP-P3的農(nóng)桿菌共浸潤本氏煙，發(fā)現(xiàn)P2和P3以及P3和P4能夠互作。說明SVBV包裹核酸形成的病毒粒子的CP蛋白（P4）能夠與