P6蛋白在草莓鑲脈病毒致病過程中的功能研究.pdf

1、植物病毒致病性的強(qiáng)弱往往與其基因組編碼的癥狀決定因子密切相關(guān)，即癥狀決定因子能夠協(xié)助該病毒成功侵染寄主，使寄主呈現(xiàn)發(fā)病癥狀甚至死亡。本研究克隆了草莓鑲脈病毒（SVBV）中國(guó)分離物P6基因，以病毒載體攜帶P6基因或P6突變體基因接種本氏煙，并以雙元表達(dá)載體攜帶P6基因轉(zhuǎn)化本氏煙和普通煙，觀察接種植株以及轉(zhuǎn)基因植株癥狀表型，明確P6在病毒侵染和癥狀形成中的作用，以確定SVBVP6的癥狀決定子功能。本研究最終將在分子水平上明確SVBV的致病機(jī)

2、制，對(duì)進(jìn)一步研究寄主植物和病毒之間防御和反防御的分子機(jī)制以及控制病毒病危害均具有重大意義。
　　 1.SVBVP6基因的克隆及序列分析從感染SVBV的草莓葉片中提取總DNA，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增SVBVP6全長(zhǎng)基因，克隆并測(cè)序。得到的SVBV中國(guó)分離物P6基因序列（SVBV-CH P6）全長(zhǎng)1557bp，編碼518個(gè)氨基酸（AA）。將其與SVBV美國(guó)分離物（SVBV-NC001725）以及花椰菜花葉病毒屬其它成員的P6全長(zhǎng)基因序列

3、相比較，結(jié)果表明，SVBV中國(guó)分離物P6基因與SVBV美國(guó)分離物P6基因核苷酸序列相似性最高，達(dá)84.5％；而與花椰菜花葉病毒屬其它成員的P6基因序列相似性均較低，僅為23.7％~27.9％。構(gòu)建SVBV及其同屬其他成員P6基因的系統(tǒng)關(guān)系樹，結(jié)果顯示，SVBV中國(guó)分離物與SVBV美國(guó)分離物單獨(dú)形成一個(gè)分支，說明來源于草莓的2個(gè)SVBV親緣關(guān)系最近，而與其同屬其它成員的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。生物信息學(xué)分析表明，SVBVP6基因表達(dá)的P6蛋白序列

4、含有多種蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)N端是一個(gè)α-螺旋富集區(qū)。
　　 2.SVBVP6基因及其系列缺失突變體植物表達(dá)載體的構(gòu)建將SVBV2個(gè)分離物P6基因及其缺失突變體基因分別克隆到病毒載體pGR106上，獲得陽性克隆pGR-CHP6，pGR-USP6，pGR-CH△P6和pGR-US△P6；將2個(gè)P6基因克隆到雙元表達(dá)載體pCAM2300 上，獲得陽性克隆pCAM-CHP6，pCAM-USP6。
　　 3.表達(dá)載體以

5、根癌土壤桿菌介導(dǎo)進(jìn)行瞬間表達(dá)利用電擊轉(zhuǎn)化方法，將表達(dá)載體pGR-CH P6，pGR-CH△P6，pGR-USP6，pGR-US△P6表達(dá)載體和pGR106空載體導(dǎo)入根癌土壤桿菌，分別接種本氏煙葉片。15d后，觀察本氏煙系統(tǒng)葉發(fā)病情況。pGR-CHP6，pGR-USP6表達(dá)載體接種的本氏煙系統(tǒng)葉呈現(xiàn)嚴(yán)重的花葉癥狀，頂部葉片皺縮，下卷；pGR-US△P6，pGR-CH△P6表達(dá)載體接種本氏煙后，其系統(tǒng)葉呈現(xiàn)輕花葉癥狀，頂部葉片基本可以展開，

6、無明顯下卷癥狀；接種pGR106空載體的系統(tǒng)葉只呈現(xiàn)PVX病毒典型的輕花葉癥狀，頂部葉片發(fā)育正常。
　　 4.瞬間表達(dá)煙草中P6基因的分子檢測(cè)提取接種本氏煙的總RNA，RT-PCR檢測(cè)PVX病毒片段和P6基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種pGR-CHP6，pGR-CH△P6，pGR-USP6，pGR-US△P6的本氏煙系統(tǒng)葉中檢測(cè)到P6基因片段和PVX病毒特異性片段。而接種空載體pGR106的本氏煙系統(tǒng)葉中則檢測(cè)不到P6基因片段，只能檢測(cè)到P

7、VX病毒特異性片段。檢測(cè)到P6基因的本氏煙進(jìn)一步進(jìn)行半定量RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)插入P6基因的表達(dá)載體和突變體表達(dá)載體接種的本氏煙，P6基因轉(zhuǎn)錄RNA水平無明顯差異。
　　 5.瞬間表達(dá)煙草中P6蛋白對(duì)PVX復(fù)制量的影響pGR-CHP6、pGR-CH△P6和pGR106分別接種本氏煙，雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)本氏煙系統(tǒng)葉中PVX的復(fù)制量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種pGR-CHP6的本氏煙系統(tǒng)葉中，PVX的復(fù)制量最高，較接種空載體pGR10

8、6的本氏煙中PVX的復(fù)制量提高了60.7％；接種pGR-CH△P6的本氏煙系統(tǒng)葉，PVX的復(fù)制量與對(duì)照相比差異不明顯。
　　 6.轉(zhuǎn)基因煙草的分子鑒定及癥狀觀察將構(gòu)建的表達(dá)載體pCAM-CHP6轉(zhuǎn)入根癌土壤桿菌，葉盤法轉(zhuǎn)化本氏煙和普通煙。提取轉(zhuǎn)基因煙草的總DNA，利用特異性引物PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草，證明已將SVBV中國(guó)分離物的P6基因轉(zhuǎn)入本氏煙和普通煙。癥狀觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因的本氏煙出現(xiàn)頂部葉片上卷癥狀；轉(zhuǎn)基因普通煙與野生型普通煙

9、相比較，并沒有呈現(xiàn)明顯發(fā)病癥狀。
　　 7.瞬間表達(dá)及轉(zhuǎn)基因煙草中P6蛋白的檢測(cè)Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，pGR-CHP6注射接種的本氏煙系統(tǒng)葉中有高豐度的P6蛋白積累。而pGR-CH△P6接種的本氏煙中，P6蛋白累積量顯著降低?？蛰d體pGR106接種的本氏煙中則檢測(cè)不到P6蛋白。
　　 轉(zhuǎn)基因本氏煙葉片中可以檢測(cè)到P6蛋白，但其積累量非常低。轉(zhuǎn)基因本氏煙P6蛋白的表達(dá)豐度甚至低于pGR-CH△P6接種的本氏煙，