草莓鑲脈病毒(SVBV)啟動(dòng)子的克隆及活性分析.pdf

1、草莓鑲脈病毒（Strawberry vein banding，virus，SVBV）是最重要的草莓病毒之一，有關(guān)SVBV啟動(dòng)子的研究，國(guó)內(nèi)至今尚無人涉及。啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的最重要元件，CaMV35S啟動(dòng)子是植物基因工程中最為常用的啟動(dòng)子，SVBV和CaMV同屬于花椰菜花葉病毒屬（Caulimovirus），其啟動(dòng)子是否具有同樣或更高的驅(qū)動(dòng)活性尚不得而知。本研究克隆了中國(guó)SVBV全長(zhǎng)啟動(dòng)子，進(jìn)一步構(gòu)建SVBV全長(zhǎng)啟動(dòng)子植物表達(dá)載體，通過

2、組織化學(xué)法和熒光光度法測(cè)定SVBV啟動(dòng)子的活性。初步鑒定SVBV全長(zhǎng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)活性已經(jīng)超過CaMV35S啟動(dòng)子。本研究將為植物基因工程提供一種新型的植物病毒強(qiáng)啟動(dòng)子，具有廣闊的實(shí)際應(yīng)用前景。
　　 1．SVBV啟動(dòng)子的克隆及序列分析
　　 用CTAB法從感染SVBV的草莓葉片中提取總DNA，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增SVBV啟動(dòng)子序列，克隆并測(cè)序，SVBV啟動(dòng)子序列（SVBV-P1）全長(zhǎng)1017 bp。將其與美國(guó)SVBV啟動(dòng)子序

3、列（SVBV-NC001725）以及花椰菜花葉病毒屬其它成員的啟動(dòng)子序列相比較，結(jié)果表明SVBV-P1與SVBV-NC001725相似性最高，達(dá)78.7％，而與花椰菜花葉病毒屬其它成員的啟動(dòng)子序列相似性均較低，僅為15.1％～25.3％。構(gòu)建啟動(dòng)子序列系統(tǒng)關(guān)系樹，結(jié)果顯示SVBV-P1與SVBV-NC001725單獨(dú)形成一個(gè)亞分支，說明來源于草莓的2個(gè)SVBV親緣關(guān)系最近，而與其同屬其它成員的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。
　　 利用Pla

4、ntCARE軟件對(duì)SVBV全長(zhǎng)啟動(dòng)子的核苷酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)SVBV全長(zhǎng)啟動(dòng)子和大多數(shù)真核啟動(dòng)子一樣都存在著一些保守基序，如在翻譯起始位點(diǎn)上游-40 bp存在一個(gè)典型的TATA-box（TTTTA），還在上游的多個(gè)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了CAAT-box，此外，在該序列中還發(fā)現(xiàn)一些潛在的植物調(diào)節(jié)因子，如GA-motif（AAGATGA）、as-2-box（GAAATGATG）等。
　　 2．SVBV啟動(dòng)子植物表達(dá)載體的構(gòu)建
　　

5、 植物表達(dá)載體pINT121本身帶有g(shù)us報(bào)告基因，將本研究克隆的SVBV全長(zhǎng)啟動(dòng)子和美國(guó)SVBV啟動(dòng)子分別與pINT121 gus基因前的35S啟動(dòng)子置換。在啟動(dòng)子序列兩端引入酶切位點(diǎn)，獲得SVBV全長(zhǎng)啟動(dòng)子陽(yáng)性克隆pGEM-P1和美國(guó)SVBV啟動(dòng)子陽(yáng)性克隆pGEM-P2。提取質(zhì)粒雙酶切，將2個(gè)啟動(dòng)子片段分別與同樣雙酶切回收的pINT121大片段連接，轉(zhuǎn)化并篩選出陽(yáng)性克隆，構(gòu)建的植物表達(dá)載體命名為pINT P1和pINT P2。

6、>　　 3．表達(dá)載體以根癌土壤桿菌介導(dǎo)進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)
　　 利用三親交配法將表達(dá)載體pINT P1、pINT P2和pINT121導(dǎo)入根癌土壤桿菌，將含有各啟動(dòng)子表達(dá)載體的根癌土壤桿菌菌液注射入本氏煙莖部，利用組織化學(xué)染色進(jìn)行啟動(dòng)子活性的定性鑒定；再用根癌土壤桿菌菌液浸潤(rùn)本氏煙葉片，利用gus熒光光度測(cè)定法進(jìn)行啟動(dòng)子活性的定量分析，觀察不同啟動(dòng)子活性強(qiáng)弱。
　　 4．gus活性的組織化學(xué)檢測(cè)和熒光活性分析
　　

7、利用組織化學(xué)法和熒光光度法測(cè)定啟動(dòng)子的活性，組織化學(xué)染色結(jié)果表明，在pINT P1、pINT P2、pINT121表達(dá)的植株莖部的維管組織和部分皮層細(xì)胞均能觀察到藍(lán)色位點(diǎn)，說明各啟動(dòng)子都能驅(qū)動(dòng)gus基因在植物細(xì)胞中表達(dá)。從各切片的gus染色強(qiáng)度上來看，pINT P1的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gus基因的表達(dá)水平要高于陽(yáng)性對(duì)照pINT121的35S啟動(dòng)子。熒光光度法測(cè)定結(jié)果表明，pINT P1的平均相對(duì)gus活性高于pINT P2和pINT121，pI