草莓鑲脈病毒運動蛋白的鑒定及功能分析.pdf

1、植物病毒編碼的運動蛋白（MP）在病毒的胞間轉移過程中擔負著重要作用。目前，草莓鑲脈病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）編碼的MP蛋白尚不明確， SVBV侵染寄主植物后，病毒粒子如何實現(xiàn)胞間轉移的機制也不清楚。因此，本研究利用亞細胞定位、質壁分離、細胞共定位以及運動缺陷型病毒載體互補試驗等方法，確定了SVBV編碼的P1蛋白是MP蛋白，再利用雙分子熒光互補（BiFC）、酵母雙雜交和凝膠阻滯等試驗方法，

2、初步探究了SVBV MP蛋白的胞間運動模式。另外，本研究制備了SVBV MP蛋白的多抗血清，為更加深入地研究SVBV MP蛋白的功能奠定了基礎。
　　1 SVBV MP蛋白的鑒定
　　克隆SVBV P1基因，插入p1300-YFP，得到重組表達質粒p1300-P1-YFP。插入pBin438，得到重組表達質粒pBin-P1。
　　（1）P1的亞細胞定位含p1300-MPTMV-YFP，p1300-P1-YFP和空載體p

3、1300-YFP的農桿菌分別浸潤本氏煙（Nicotiana benthamiana）葉片，浸潤p1300-MPTMV-YFP和p1300-P1-YFP后，熒光在細胞壁上呈不連續(xù)的點刻狀分布，而浸潤空載體p1300-YFP，細胞壁上沒有出現(xiàn)不連續(xù)的點刻狀熒光。
　?。?）P1與MPTMV的共定位 p1300-P1-YFP與MPTMV-RFP共浸潤本氏煙葉片。P1與MPTMV可以在胞間連絲（plasmodesmata, PD）共定位。

4、
　　（3）P1的胞間運動含p1300-MPTMV-YFP，p1300-P1-YFP和空載體p1300-YFP的農桿菌稀釋至OD600=0.001，分別浸潤本氏煙葉片，發(fā)現(xiàn)p1300-MPTMV-YFP， p1300-P1-YFP能在本氏煙細胞間自主運動并擴散到周圍鄰近細胞，而p1300-YFP僅定位于單個細胞，不能向鄰近細胞擴散。
　?。?） P1的運動回補功能將pBin-P1、pBin-P25及空載體pBin438分別與

5、PVX(△P25)-GFP共浸潤本氏煙葉片。結果表明， pBin-P1與pBin-P25都能夠互補PVX(△P25)-GFP在本氏煙細胞間的運動，而空載體 pBin438不能互補PVX(△P25)-GFP在本氏煙細胞間的運動。
　　上述研究表明，SVBV編碼的P1蛋白能定位于細胞外圍，質壁分離實驗進一步表明，P1能在細胞壁上形成不連續(xù)的點刻狀；通過與MPTMV共定位實驗，進一步確認了P1定位的位置是在PD處；P1不僅具有自主運動功

6、能，而且能回補運動缺陷型病毒載體的運動功能。因此，鑒定SVBV編碼的P1蛋白是MP蛋白。
　　2 SVBV P1蛋白與P4蛋白（CP蛋白）互作的驗證
　　克隆SVBV P1和P4基因，分別插入pCV-cYFP和pCV-nYFP構建重組表達載體pCV-P1-cYFP、pCV-P1-nYFP、pCV-P4-cYFP和pCV-P4-nYFP。分別插入pGADT7和pGBKT7構建重組表達載體pGAD-P1、pGBK-P1、pGAD

7、-P4和pGBK-P4。
　?。?）BiFC驗證P1與P4的互作將pCV-P1-nYFP與pCV-P4-cYFP及pCV-P1-cYFP與pCV-P4-nYFP分別共浸潤本氏煙。結果發(fā)現(xiàn)，有完整的細胞出現(xiàn)黃色熒光，確認了SVBV編碼的P1蛋白能與P4蛋白互作。
　　（2）酵母雙雜交驗證P1與P4的互作將pGAD-P1與pGBK-P4及pGAD-P4與pGBK-P1分別共轉化酵母，結果發(fā)現(xiàn)，僅pGAD-P4與pGBK-P1共轉

8、化，平板上能夠生長出白色酵母菌落，說明P1能夠與P4互作。
　　3 SVBV P1蛋白與dsDNA結合能力的驗證
　　體外轉錄250 bp dsDNA片段，并用[Dig] UTP標記，將標記后的dsDNA片段和純化的P1蛋白混合孵育，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，顯色后發(fā)現(xiàn)，P1不能阻滯dsDNA的遷移，故P1不具有dsDNA結合能力。
　　4 SVBV P1蛋白的原核表達及其多抗血清的制備
　　將P1基因插入原核表達載