灰飛虱體內(nèi)與大麥黃條點(diǎn)花葉病毒核衣殼蛋白互作的蛋白鑒定及功能分析.pdf

1、灰飛虱（Laodelphax striatellus Fallen）是危害農(nóng)作物的一種重要遷飛性害蟲(chóng)，其寄主范圍廣泛，可通過(guò)取食植物汁液傳播斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)、纖細(xì)病毒屬（Tenuivirus）和細(xì)胞質(zhì)彈狀病毒屬（Cytorhabdovirus）等多個(gè)屬的病毒，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)形成極大威脅，已多次造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。切斷灰飛虱對(duì)病毒的傳播是防治病毒病最行之有效的方法之一。目前，對(duì)于灰飛虱傳播斐濟(jì)病毒屬、纖細(xì)病毒屬病毒的機(jī)制研究已經(jīng)

2、取得一定進(jìn)展，但灰飛虱與植物彈狀病毒的互作機(jī)制卻少有研究。本文以灰飛虱及其傳播的大麥黃條點(diǎn)花葉病毒(Barley yellow striate mosaic virus，BYSMV)為研究對(duì)象開(kāi)展灰飛虱與彈狀病毒的傳毒機(jī)制研究，篩選與灰飛虱獲毒或互作相關(guān)的介體蛋白并解析功能，為阻斷植物彈狀病毒乃至以灰飛虱為介體的多種病毒的傳播提供新的位點(diǎn)靶標(biāo)具有重要科學(xué)意義。
　　本研究首先構(gòu)建了含全長(zhǎng)BYSMV核衣殼蛋白(N)基因的誘餌載體pD

3、HB1-N，功能驗(yàn)證結(jié)果表明pDHB1-N能在酵母內(nèi)正常表達(dá)并行使功能。其次對(duì)文庫(kù)篩選條件進(jìn)行優(yōu)化，確定His基因產(chǎn)物抑制劑3-氨基-1，2，4-三唑(3-AT)的使用濃度為12mM時(shí)可去除可能存在的輕微篩庫(kù)背景。然后利用分離泛素酵母雙雜交系統(tǒng)，以pDHB1-N為誘餌對(duì)灰飛虱cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，對(duì)得到的57個(gè)陽(yáng)性克隆的序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其中的20個(gè)序列可匹配到褐飛虱等物種的同源蛋白。利用GO注釋對(duì)得到的表皮蛋白、泛素和核糖體膜相關(guān)

4、蛋白等20個(gè)候選蛋白進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)它們具有轉(zhuǎn)運(yùn)活性、氧化還原酶活性及結(jié)構(gòu)分子活性等功能，參與細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程及應(yīng)激反應(yīng)等多個(gè)生理過(guò)程，并存在于細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外區(qū)域等不同細(xì)胞組分中。信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)它們主要參與了脂肪酸生物合成，脂質(zhì)代謝，信號(hào)傳導(dǎo)途徑等多個(gè)通路過(guò)程。同時(shí)，經(jīng)酵母雙雜交共轉(zhuǎn)驗(yàn)證和β-半乳糖苷酶檢測(cè)檢測(cè)進(jìn)一步確認(rèn)了其中的17個(gè)候選蛋白與BYSMV N發(fā)生互作。
　　本實(shí)驗(yàn)室已在灰飛虱與水稻條紋病毒的互作機(jī)制研究

5、中發(fā)現(xiàn)灰飛虱的表皮蛋白CPR1可與水稻條紋病毒結(jié)合，幫助病毒逃避寄主血淋巴的免疫作用從而保護(hù)病毒不被降解。本文也通過(guò)篩庫(kù)獲得了同一表皮蛋白CPR1的全長(zhǎng)基因，將其大量表達(dá)并進(jìn)行純化后，利用GST pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CPR1可與BYSMVN蛋白發(fā)生體外互作。為明確CPR1在灰飛虱傳播BYSMV中的功能，利用RNAi技術(shù)將合成的CPR1雙鏈RNA（GFP為對(duì)照）顯微注射至三齡帶毒灰飛虱體內(nèi)，明確沉默CPR1對(duì)灰飛虱傳播BYSMV的

6、影響。CPR1被沉默后，RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)BYSMV在灰飛虱體內(nèi)的含量隨著CPR1mRNA轉(zhuǎn)錄水平的降低明顯下降，注射后第六天下降幅度最高可達(dá)71.84％。同時(shí)，生物學(xué)接種實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)灰飛虱的傳毒效率在沉默CPR1后下降了51.73％。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CPR1可在灰飛虱獲毒或傳毒過(guò)程中起到重要作用。此外，研究表明多種含有幾丁質(zhì)結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域的表皮蛋白參與了禾谷黃矮病毒(CYDV)、黃瓜花葉病毒(CMV)等病毒在介體內(nèi)的傳播，推測(cè)CP