黃瓜花葉病毒人工假重組體與衛(wèi)星RNA的互作研究.pdf

1、黃瓜花葉病毒(Cucumbe.Mosai.Virus，CMV)能侵染包括茄科、十字花科、豆科等重要經(jīng)濟(jì)作物在內(nèi)的1000多種單子葉和雙子葉植物，是寄主最多、分布最廣、對農(nóng)作物危害最為嚴(yán)重的植物病毒之一。CMV為三分體+ssRNA病毒，主要通過突變、重組和假重組等方式進(jìn)行變異和進(jìn)化，使之能夠不斷適應(yīng)新的環(huán)境和新的寄主，并且其基因組結(jié)構(gòu)簡單，因此CMV是研究RNA病毒在寄主上致病機(jī)制的模式病毒之一。衛(wèi)星RNA(SatelliteRNA，sa

2、tRNA)是一類依賴于輔助病毒(Helpe.virus)進(jìn)行復(fù)制、包被和在寄主內(nèi)擴(kuò)散的低分子量的RNA，是寄生于病毒的亞病毒，影響輔助病毒在寄主植物上的癥狀表達(dá)。本研究對CMV亞組IA和亞組II間的假重組體Tsh-CM.(RNA2、RNA3)和Fny-CMV的R1、R2及R3進(jìn)行人工交叉重組獲得一系列人工假重組體(FIF2F3，F(xiàn)IF2T3，F(xiàn)IT2F3，F(xiàn)IT2T3)，各個(gè)假重組體分別接種于心葉煙、本生煙以及番茄，在不同的接種時(shí)間分析

3、各種寄主上的生物學(xué)表型，同時(shí)并采用Norther.blot分析CMV各個(gè)ORF的含量以期研究引起癥狀差異的原因。并以此為輔助病毒和Tsh-satRNA混合接種于心葉煙和本生煙上，分析該衛(wèi)星的存在對輔助病毒癥狀的調(diào)控情況，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Norther.blot分析該衛(wèi)星和這些輔助病毒各基因組積累量之間的影響。
　　 主要結(jié)果如下：四個(gè)假重組體CMV的表型在各寄主上存在差異，具體為在心葉煙上，F(xiàn)IF2T3致病性最嚴(yán)重，表

4、現(xiàn)為嚴(yán)重矮化，黃化及叢簇；FIT2T3致病性次之，表現(xiàn)為矮化，局部性枯斑及叢簇；繼而為FIF2F3，表現(xiàn)為典型花葉，缺刻及線性化葉片；FIT2F3癥狀最輕，僅表現(xiàn)為輕微花葉。在本生煙上，F(xiàn)IF2T3表現(xiàn)為嚴(yán)重矮化，黃化，致病性最重；F112T3表現(xiàn)為矮化，黃化，泡狀花葉，致病性次之：FIF2F3表現(xiàn)為矮化，典型泡狀花葉，但不引起黃化；而F1T2F3也是癥狀最輕，僅輕花葉，也不引起矮化黃化。在番茄合作903上，F(xiàn)1F2T3和F1T2T3表

5、現(xiàn)為典型花葉，矮化：而F1T2F3矮化不明顯，且表現(xiàn)為輕微花葉；F1F2F3表現(xiàn)為典型花葉，線性葉。通過生物學(xué)表型分析，也是F1F2T3最重，F(xiàn)1T2T3和F1F2F3次之，F(xiàn)1T2F3最輕。
　　 Northern雜交結(jié)果顯示：各假重組體病毒侵染心葉煙7天，14天，21天，28天后，F(xiàn)1F2F3-CMV，F(xiàn)1F2T3-CMV，F(xiàn)1T2F3-CMV和F1T2T3-CMV的基因組含量在7天時(shí)含量較高，在14天時(shí)含量最高，此后21天

6、和28天檢測到CMV基因組含量較少且呈逐漸下降趨勢。F1F2F3-CMV和F1T2F3-CMV的基因組含量比F1F2T3-CMV和F1T2T3-CMV高。這與F1F2T3-CMV和F1T2T3-CMV在各寄主上致病性最為嚴(yán)重而F1T2F3-CMV在各寄主上癥狀較輕不一致，雜交結(jié)果顯示其癥狀的輕重與CMV基因組含量無關(guān)。
　　 電鏡組織切片結(jié)果顯示：Mock結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)含淀粉粒較大；侵染Fny后有少量淀粉粒存在，空泡化不明顯；攜帶

7、Tsh-satRNA后的Fny結(jié)構(gòu)和未侵染病毒的較相似，也較完整，而內(nèi)含淀粉粒較未侵染病毒的更大。
　　 各假重組體攜帶Tsh-satRNA后，在各寄主上癥狀均減輕，僅表現(xiàn)輕微花葉癥狀。對心葉煙上CMV及攜帶Tsh-satRNA后各ORF的熒光定量檢測結(jié)果顯示：各假重組體CMV1a.2a.2b，3a和cp的開放閱讀框的相對量是攜帶Tsh-satRNA后含量的2.78-8.64倍之間。其中攜帶Tsh-satRNA后2.ORF相對含

8、量減少最多，F(xiàn)1F2F3-CMV，F(xiàn)1F2T3-CMV，F(xiàn)1T2F3-CMV和F1T2T3-CM.2b的開放可閱讀框的相對含量分別是攜帶Tsh-satRNA后的6.78，8.35，7.31，5.31倍。總體上F1F2F3與F1T2F3的1a，2a，2b，3a，cp的開放閱讀框的相對量比F1F2T3與F1T2T3的高。Norther.blot結(jié)果同樣顯示，攜帶Tsh-satRNA后各CMV基因組含量明顯減少。
　　 總的來說，攜帶

9、Tsh-satRNA后各假重組體CMV的基因組含量減少，這也是攜帶Tsh-satRNA后各假重組體CMV在不同寄主上癥狀都減輕的原因。在不攜帶Tsh-satRNA時(shí)，各假重組體病毒基因組含量也有差異，F(xiàn)1F2F3-CMV和F1T2F3-CMV的基因組含量相對于F1F2T3-CMV和F1T2T3-CMV反而高，這與F1F2T3-CMV和F1T2T3-CMV在各寄主上致病性最為嚴(yán)重而F1T2F3-CMV在各寄主上癥狀較輕不一致，所以說明F1