黃瓜花葉病毒衛(wèi)星RNA在系統(tǒng)寄主中積累量的研究.pdf

1、黃瓜花葉病毒(CucumberMosaicVirus，CMV)能侵染包括茄科、十字花科、豆科等重要經(jīng)濟(jì)作物在內(nèi)的1000多種單子葉和雙子葉植物，是寄主最多、分布最廣、對(duì)農(nóng)作物危害最為嚴(yán)重的植物病毒之一，并且其基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，因此CMV是研究RNA病毒在寄主上致病機(jī)制的模式病毒之一。衛(wèi)星RNA(SatelliteRNA，satRNA)是一類依賴于輔助病毒(Helpervirus)進(jìn)行復(fù)制、包被和在寄主內(nèi)擴(kuò)散的低分子量的RNA，是寄生于病毒

2、的亞病毒，影響輔助病毒在寄主植物上的癥狀表達(dá)。本文對(duì)黃瓜花葉病毒兩種衛(wèi)星RNA(T1sat和2msat)進(jìn)行了克隆和序列分析，并在此基礎(chǔ)上分析衛(wèi)星T1sat對(duì)不同輔助病毒的癥狀調(diào)控，確定衛(wèi)星2msat5’端的不同堿基對(duì)其在煙草上積累量的影響，研究2mF5sat在煙草上低含量積累的分子機(jī)制。 黃瓜花葉病毒衛(wèi)星克隆及序列分析以CMV侵染的番茄總RNA為模板，通過RT-PCR方法獲得了一衛(wèi)星RNA，對(duì)其進(jìn)行克隆、測(cè)序結(jié)果顯示：該衛(wèi)星大

3、小為337堿基(命名為T1sat)，序列登陸號(hào)DQ785472。T1sat與國(guó)內(nèi)外其他地區(qū)報(bào)道的43個(gè)衛(wèi)星RNA序列進(jìn)行多態(tài)性分析表明：CMV衛(wèi)星RNA的同源性與地區(qū)分布相關(guān)，與寄主來源等沒有明確的相關(guān)性。參照T1sat的克隆方法，在本研究中，還獲得了一大小為335nt的CMV-satRNA(2msat)，序列登陸號(hào)EU022373。 T1sat對(duì)不同寄主的癥狀調(diào)控將克隆的番茄株系T1sat與CMV-Fny假重組于煙草、番茄和西

4、葫蘆中，分析該衛(wèi)星的存在對(duì)輔助病毒癥狀的調(diào)控情況，并采用RealtimeRT-PCR技術(shù)分析該衛(wèi)星RNA對(duì)CMV-Fny各個(gè)基因組積累量的影響。結(jié)果表明：T1sat能延緩或減輕CMV-Fny在煙草上的癥狀反應(yīng)；添加衛(wèi)星T1sat后，CMV-Fny在番茄上癥狀加重：CMV-Fny和CMV-Fny+T1sat在西葫蘆上均引起花葉皺縮癥狀，T1sat對(duì)西葫蘆中CMV-Fny的癥狀沒有影響。T1sat與CMV假重組后對(duì)不同寄主體內(nèi)CMV各基因組

5、RNA的定量結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：T1sat均抑制輔助病毒在煙草和番茄基因組的積累量，且在番茄寄主中病毒基因組含量受到抑制效應(yīng)更明顯；而西葫蘆中，CMV-Fny基因組的積累量不受T1sat影響。因此，CMV-Fny在寄主上的不同癥狀可能與病毒基因組含量不相關(guān)。 2msat的5’端突變體對(duì)其在煙草上積累量的影響大多數(shù)CMV-satRNA5’端起始序列為“5’-GUUUUGUUU﹍﹍-3’”，本研究中克隆的衛(wèi)星2msat5’端序列為“5’-

6、GUUGUUU﹍﹍-3’”，通過PCR.技術(shù)對(duì)其5’端序列(5’-GUUGUUUG﹍﹍-3’)進(jìn)行堿基添加/缺失構(gòu)建一系列2msat的5’端突變體，并將2msat及其突變體分別與CMV-Fny假重組接種于煙草。在不同的接種時(shí)間用RT-PCR和Real-timeRT-PCR分析5’端改變對(duì)其在寄主中積累量的影響。結(jié)果表明：在2msat5’端(5’-GUUGUUUG-3’)中缺失或添加第1個(gè)G后面的1～2個(gè)U，不影響以CMV-Fny為輔助病

7、毒的2msat在煙草中的復(fù)制，而在其分子5’端缺失4個(gè)堿基(GUUG)后則不能進(jìn)行復(fù)制，因此2msat5’端的GUUU結(jié)構(gòu)是起始其復(fù)制的前提。同時(shí)在煙草系統(tǒng)葉中，除2mF4sat以外，各個(gè)衛(wèi)星RNA的含量在接種后期呈下降趨勢(shì)，這可能是由于2msat的5’端改變影響其長(zhǎng)距離運(yùn)輸，從而干擾寄主中衛(wèi)星RNA的積累量。 第288位C堿基決定2mF5sat在煙草中的低含量積累2msat突變體在煙草中相對(duì)含量分析的結(jié)果表明2mF4sat與T

8、1sat在煙草系統(tǒng)葉中含量均較高，而2mF5sat的含量很低。而T1sat與2mF5sat只在第288位點(diǎn)具有一個(gè)堿基的差異：2mF5(C288)和T1sat(U288)。本研究通過對(duì)該位點(diǎn)定點(diǎn)突變，獲得該位點(diǎn)的4個(gè)突變體2mF5(G288)、2mF5(A288)、2mF5(C288)以及T1sat(U288)。結(jié)果表明：衛(wèi)星T1sat(U288)、2mF5(A288)和2mF5(G288)均能在煙草系統(tǒng)葉中高含量積累，而2mF5(C2

9、88)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于前3者的含量，因此2mF5sat第288化的C堿基決定了該satRNA在煙草中的低含量積累。等量病毒粒子中的RNA分析結(jié)果表明，CMV-Fny+T1sat和CMV-Fny+2mF5接種葉中這病毒粒子的satRNA的含量無明顯的差別，而在系統(tǒng)葉中T1sat的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于2mF5sat，因此以CMV-Fny為輔助病毒，2mF5sat在煙草系統(tǒng)葉中的低含量積累與其包被效率沒有關(guān)系。不同的接種時(shí)間2mF5sat相對(duì)含量分析結(jié)果