甜菜壞死黃脈病毒RNA5功能分析及甜菜抗病品種的鑒定.pdf

1、利用初提純的BNYVV病毒免疫兔子制備了病毒的?；钥寡?通過間接ELISA測(cè)定兩只兔子的最適工作濃度分別位為3600倍和3000倍,可用于BNYVV接種試驗(yàn)和田間樣品分析中對(duì)病毒的Western blot檢測(cè).對(duì)采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市甜菜叢根病田的13個(gè)測(cè)試品種進(jìn)行了田間癥狀調(diào)查,發(fā)現(xiàn)內(nèi)甜抗201、DF1028、KW0149、KW9419、內(nèi)101、ZD204、01NSZ單7個(gè)品種抗性強(qiáng),并且這7個(gè)品種的點(diǎn)雜交檢測(cè)結(jié)果顯示除KW9

2、419外的6個(gè)抗病品種根內(nèi)檢測(cè)不到病毒RNA存在.但內(nèi)甜抗201和KW0149利用RT-PCR方法卻能檢測(cè)到病毒存在,表明這類品種雖能抑制病毒的增殖但不能抵抗BNYVV的侵入.野生型RNA5的體外轉(zhuǎn)錄物與含Hu3(RNA1+2+3)分離物的總RNA混合接種番杏葉片的RT-PCR和Northern blot檢測(cè)結(jié)果都表明,野生型RNA5能夠在接種寄主體內(nèi)復(fù)制,并且ELISA檢測(cè)證明含有RNA5的番杏病葉中病毒濃度高于不含RNA5病葉的病毒

3、濃度.以Hu3+RNA5混合侵染和Hu3單獨(dú)侵染的番杏葉片作為毒源分別摩擦接種甜菜根部,Hu3+RNA5混合接種的發(fā)病率高于Hu3單獨(dú)接種的近10﹪,同時(shí)利用簡(jiǎn)單快速的RT-PCR方法在甜菜根內(nèi)能夠檢測(cè)到RNA5存在,說明RNA5的存在可以提高接種效率.RNA5的各種編碼區(qū)缺失體及ATG點(diǎn)突變體的轉(zhuǎn)錄物能在接種的番杏葉片內(nèi)復(fù)制,但在繼代接種試驗(yàn)中卻檢測(cè)不到缺失型RNA5存在.因此,對(duì)野生型RNA5和其中一個(gè)突變體的5'和3'端非編碼區(qū)進(jìn)

4、行測(cè)序,比較發(fā)現(xiàn)3'端序列無明顯差異,而5'端序列在350-353nt,364-370nt處分別缺失AAAA和AATAAAA,推測(cè)這些缺失造成了RNA5編碼區(qū)缺失突變體能夠復(fù)制但不能被包裝進(jìn)病毒粒子.為研究RNA 5編碼的P26蛋白的亞細(xì)胞定位,構(gòu)建了P26-eGFP融合表達(dá)和eGFP替代P26基因的RNA5載體.用BNYVV侵染的番杏葉片總RNA接種本生煙,10天后未接種的上部葉片出現(xiàn)系統(tǒng)癥狀,RT-PCR檢測(cè)表明BNYVV能夠系統(tǒng)侵