甜菜黑色焦枯病毒和煙草壞死病毒的比較病毒學(xué)研究.pdf

1、甜菜黑色焦枯病毒(Beet black scorch virus,BBSV)新疆分離物(BBSV-X)與寧夏分離物(BBSV-N)在致病性分存在明顯差異.以病毒RNA為模板,RT-PCR方法獲得了BBSV-X全長(zhǎng)cDNA克隆.序列分析顯示,BBSV-X基因組RNA全長(zhǎng)為3644個(gè)核苷酸(nt).與BBSV-N相比,二者的基因組結(jié)構(gòu)基本相同,全長(zhǎng)序列核苷酸一致性高達(dá)98.9﹪.但在ORF2的889~975nt之間,BBSV-X比BBSV-

2、N間隔性多出了3個(gè)核苷酸,因而導(dǎo)致p82蛋白(復(fù)制酶)的部分氨基酸(285~312aa)發(fā)生移碼突變.與BBSV-N相比,p82蛋白的氨基酸序列一致性僅為95.4﹪.構(gòu)建獲得BBSV-X的侵染性cDNA克隆后,將BBSV-X復(fù)制酶中的差異區(qū)段與BBSV-N互換.體外轉(zhuǎn)錄物分別接種莧色藜(Chenopodium amaranticolor)和豇豆(Vigna sinensis),觀察互換復(fù)制酶變異片段重組體的寄主范圍及所造成的癥狀.由于未

3、發(fā)現(xiàn)由此引起的相應(yīng)變化,故認(rèn)為BBSV復(fù)制酶基因變異可能與其對(duì)莧色藜和豇豆的致病性差異沒(méi)有關(guān)系.構(gòu)建了35S啟動(dòng)子控制下的BBSV衛(wèi)星RNA(sat-RNA)全長(zhǎng)侵染性克隆,侵染性檢測(cè)表明,所獲得的3個(gè)克隆均有較好的侵染性.構(gòu)建了BBSV-X基因組6個(gè)缺失和插入突變體,將它們的體外轉(zhuǎn)錄物單獨(dú)或與sat-RNA一起混合接種莧色藜,初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,sat-RNA能增強(qiáng)全長(zhǎng)BBSV-X基因組及含全長(zhǎng)基因組的突變體對(duì)莧色藜所致的癥狀,但減輕C

4、P缺失突變體的致病性.為研究壞死病毒屬(Necrovirus)新成員BBSV與其它成員間的相互關(guān)系,對(duì)Necrovirus的典型成員煙草壞死病毒(Tobacco necrosis virus,TNV)中國(guó)大豆分離物進(jìn)行了較為系統(tǒng)的生物學(xué)、理化特性及血清學(xué)特性等方面的研究.結(jié)果表明,TNV中國(guó)大豆分離物體外非常穩(wěn)定,人工接種能侵染8科29種植物,多產(chǎn)生局部枯斑,但系統(tǒng)侵染大豆和本珊煙;利用提純的病毒,制備了高效價(jià)的特異抗血清.在血清學(xué)方面

5、,TNV大豆分離物與柳樹(shù)分離物密切相關(guān),大豆分離物與TNV-D和BBSV無(wú)血清學(xué)關(guān)系.根據(jù)已報(bào)道的TNV-A和TNV-D的核苷酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并此物,以TNV中國(guó)大豆分離物基因組RNA為模板,RT-PCR擴(kuò)增獲得部分片段的cDNA,再根據(jù)所獲序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增和3',5'RACE,獲得了TNV中國(guó)大豆分離物的全基因組序列.序列分析表明,TNV中國(guó)大豆分離物基因組RNA全長(zhǎng)為3682nt,含有5個(gè)開(kāi)發(fā)閱讀框;序列比對(duì)顯示,T

6、NV中國(guó)大豆分離物與已報(bào)道的TNV-A、TNV-D和TNV-D<'H>的序列一致性分別為86.4﹪、43.7﹪和44.3﹪.根據(jù)生物學(xué)特性與全基因組的核苷酸序列,認(rèn)為T(mén)NV中國(guó)大豆分離物屬于TNV-A的一個(gè)新株系,命名為T(mén)NV-A<'C>.分別構(gòu)建了T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子和35S啟動(dòng)子控制的TNV-A<'C>侵染性cDNA克隆,通過(guò)分析ORF1、ORF3、ORF4、ORF5突變體對(duì)TNV-A<'C>侵染和復(fù)制效率的影響,初步證明,TN