急性病毒性壞死病毒dUTPase基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)是我國北方沿海重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類之一,但自1997年起連續(xù)暴發(fā)的“大規(guī)模死亡癥”導(dǎo)致了該產(chǎn)業(yè)的巨大損失。近年的研究證實(shí),急性病毒性壞死病毒(Acute virus necrosis virus,AVNv)是其主要的致病病原。該病毒為雙鏈DNA病毒,病毒顆粒為具囊膜的二十面體結(jié)構(gòu),直徑大小為130～170nm。2009年,任偉成等完成了AVNV病毒的全基因組測(cè)序分析,預(yù)測(cè)AVNV基因組中含有123

2、個(gè)潛在的開放閱讀框(open reading,flames,ORF),其中44個(gè)ORF具有一定的結(jié)構(gòu)和功能,推測(cè)可能與病毒DNA復(fù)制、核酸代謝、修飾以及病毒與宿主相互作用等有關(guān)。而ORF074推測(cè)為編碼脫氧尿苷焦磷酸酶(dUTP pyrophosphatase,dUTPase)的基因,主要與病毒DNA復(fù)制有關(guān)(任偉成等,2009)。
　　脫氧尿苷焦磷酸酶(dUITP pyrophosphatase,dUTPase)是一種生物界普遍

3、存在的重要水解酶,它與DNA復(fù)制和病毒毒力密切相關(guān)。為確定ORF074是否編碼特定的具有功能的酶或蛋白,以及編碼蛋白在AVNV感染、復(fù)制及AVND暴發(fā)中的作用,作者根據(jù)櫛孔扇貝急性病毒性壞死病毒ORF074基因序列,構(gòu)建了dUTPase基因的原核表達(dá)載體,在E.coli中進(jìn)行原核表達(dá)、純化并對(duì)重組dUTPase的酶學(xué)活性進(jìn)行了分析;構(gòu)建了dUTPase基因的真核表達(dá)載體pEGFP-N1-dut并在草魚腎臟細(xì)胞(CIK)中進(jìn)行了真核表達(dá)及

4、亞細(xì)胞定位分析。此外,對(duì)AVNV病毒感染櫛孔扇貝不同時(shí)間的基因表達(dá)進(jìn)行熒光定量PCR分析,在mRNA水平進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和表達(dá)時(shí)序分析,探討了基因?qū)Σ《驹谒拗黧w內(nèi)復(fù)制的影響。另外,為構(gòu)建AVNV的體外擴(kuò)增系統(tǒng),為更深入研究其侵染機(jī)制和致病機(jī)理提供技術(shù)平臺(tái),取健康櫛孔扇貝的外套膜、血淋巴、鰓、閉殼肌、腎臟等組織進(jìn)行體外的原代和傳代培養(yǎng),初步研究并建立了櫛孔扇貝組織細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù),為之后的研究提供了有益的探索。
　　1.AVNV dUTP

5、ase基因的克隆及原核重組表達(dá)。根據(jù)AVNV基因組序列,設(shè)計(jì)特異性引物,擴(kuò)增編碼AVNV dUTPase的ORF074,經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳得到一條約750bp大小的條帶,雙酶切后將其連接至pET32a中構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET32a-dut,并將其轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中,加IPTG至終濃度1mmol/L,誘導(dǎo)4-5小時(shí)后,SDS-PAGE電泳,得到一條約45kD的條帶,經(jīng)Western-blot及質(zhì)譜分析確定為重組dU

6、TPase。
　　2.重組dUTPase的純化及酶學(xué)活性分析。利用Co2+親和層析柱對(duì)表達(dá)的重組dUTPase進(jìn)行了純化并測(cè)定了純化的重組dUTPase的比活、底物特異性、不同金屬離子及EDTA對(duì)其活性的影響等。結(jié)果顯示:1、重組dUTPase具有較強(qiáng)的底物特異性,能特異的催化dUTP水解。2、Mg2+、Ca2+、Co2+、Zn2+等金屬離子能增強(qiáng)重組dUTPase的催化活性,其中Mg2+作用效果最顯著,依次為Mg2+＞Ca2+＞

7、Co2+＞Zn2+。3、EDTA能抑制重組dUTPase的活性,而Mg2+、Ca2+、Co2+、Zn2+等金屬離子能在一定程度上解除這種抑制作用。
　　3.利用熒光定量PCR技術(shù)完成了AVNV病毒感染櫛孔扇貝后,dUTPase基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)序分析。分別取感染AVNV病毒0,4,8,12,16,24,36,48 h后櫛孔扇貝的肝胰腺,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄,熒光定量PCR,確定了dUTPase基因在不同時(shí)間的表達(dá)。結(jié)果表明:該基因是一種

8、早期基因,在AVNV感染櫛孔扇貝4h后即開始表達(dá),16h后達(dá)到峰值,之后逐步下降。
　　4.利用RACE技術(shù)確定了dUTPase基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。利用5’RACE技術(shù)確定了dUTPase基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。首先用AVNV病毒感染櫛孔扇貝,16h后提取肝胰腺的總RNA,隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄,用末端轉(zhuǎn)移酶加poly(C)尾巴,之后用根據(jù)dUTPase基因設(shè)計(jì)的GSP引物及Adaptor(dG)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到一條約250bp的條帶,經(jīng)

9、測(cè)序發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為起始密碼子上游第十個(gè)核苷酸——胸腺嘧啶脫氧核苷酸。
　　5.構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體pEGFP-N1-dut,并將其轉(zhuǎn)染進(jìn)草魚腎臟細(xì)胞(CIK)中進(jìn)行了真核表達(dá)及亞細(xì)胞定位分析。根據(jù)dUTPase基因的序列,設(shè)計(jì)真核表達(dá)用的特異性引物,雙酶切后將其連接至真核表達(dá)載體pEGFP-N1中,構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pEGFP-N1-dut,將重組載體轉(zhuǎn)染至草魚腎臟細(xì)胞(CIK)中,48h后,激光共聚焦顯微鏡觀察其在CI

10、K中的表達(dá)。表明重組質(zhì)粒在CIK細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)。
　　6.培養(yǎng)得到了櫛孔扇貝鰓、腎臟、閉殼肌、外套膜、血淋巴等5種組織的細(xì)胞,并進(jìn)行了傳代。取1齡、2齡櫛孔扇貝的血淋巴、鰓、腎臟、閉殼肌、外套膜等5種組織進(jìn)行組織培養(yǎng),并將培養(yǎng)的以上5種組織進(jìn)行傳代,血淋巴細(xì)胞第二代即死亡,其他四種組織前2代生長良好,但至第三代死亡。
　　綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可以得出以下結(jié)論:AVNV ORF074編碼具有活性的dUTPase,該