急性病毒性壞死病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及奧爾森帕金蟲環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法的建立.pdf

1、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)是我國北方沿海主要的貝類養(yǎng)殖品種之一?！凹毙圆《拘詨乃啦《尽?Acute Viral Necrosis Virus;AVNV)經(jīng)證實是一種能對櫛孔扇貝造成極大危害的病原體。本文應(yīng)用PCR檢測方法,對青島流清河灣和榮成桑溝灣養(yǎng)殖櫛孔扇貝、養(yǎng)殖設(shè)施大型附著污損生物及在全國6省14個養(yǎng)殖海區(qū)采集到的貝類樣品進行AVNV檢測分析,以探討AVNv在全國的分布、可侵染宿主、感染增值規(guī)律以及可能的傳播途徑。同

2、時,建立了奧爾森帕金蟲(Perkinsusolseni,P.olseni)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)并進行應(yīng)用,從而為貝類健康養(yǎng)殖模式的探索、提出以及建立貝類大規(guī)模死亡的疾病防疫模式奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。
　　本文應(yīng)用PCR方法連續(xù)一周年檢測兩個不同貝類養(yǎng)殖海區(qū)櫛孔扇貝樣品攜帶AVNv的情況。檢測結(jié)果顯示,2010年青島流清河灣樣品在8月份AVNV陽性

3、檢出率最高,櫛孔扇貝野生苗和蓬萊紅分別高達(dá)60％和30％,櫛孔扇貝的
　　AVNV陽性檢出率與櫛孔扇貝大規(guī)模死亡流行病學(xué)特征具有正相關(guān)性,高溫(7月、8月和9月份海水平均溫度23℃以上)可能是導(dǎo)致AVNV侵染櫛孔扇貝并致其死亡的重要環(huán)境脅迫因子;桑溝灣扇貝養(yǎng)殖海區(qū)屬于貝藻混養(yǎng)海區(qū),全年櫛孔扇貝的AVNV陽性檢出率均較低,櫛孔扇貝樣品的AVNV陽性檢出率最高時間為2010年8月,蓬萊紅、人工育苗和野生苗AVNV陽性檢出率分別為20％

4、、10％和20％。2010年流清河扇貝養(yǎng)殖場野生苗和蓬萊紅存活率分別為37.41％和61.33％;桑溝灣扇貝養(yǎng)殖海區(qū)蓬萊紅、人工育苗、野生苗存活率分別為96.67％、92.5％、94.17％,表明貝藻混養(yǎng)的養(yǎng)殖模式與單一養(yǎng)殖模式相比,可以保持養(yǎng)殖海區(qū)的生態(tài)環(huán)境在一個穩(wěn)定可持續(xù)發(fā)展的狀態(tài),抑制AVNV侵染櫛孔扇貝或阻止AVNV的傳播,從而降低櫛孔扇貝發(fā)病率。
　　對2010-2011年青島流清河灣與榮成桑溝灣兩個不同海區(qū)養(yǎng)殖櫛孔扇貝

5、的扇貝養(yǎng)殖設(shè)施上常見的幾種大型附著污損生物進行檢測,以探討其能否攜帶AVNV,是否為AVNV的潛在宿主,以及AVNV傳播過程中污損生物所起的作用。兩個養(yǎng)殖海區(qū)中紫貽貝、麥稈蟲和長牡蠣樣品均檢出AVNV陽性,青島流清河灣養(yǎng)殖海區(qū)的東方縫棲蛤未檢出有AVNV陽性,表明紫貽貝、麥稈蟲和長牡蠣可攜帶AVNV,為AVNV的宿主,東方縫棲蛤與柄海鞘未檢出AVNV陽性,可能不是AVNV的宿主。
　　自2010年5月至2011年12月間,從中國沿

6、海6省14個養(yǎng)殖海區(qū)共采集24批次390份樣品,其中包括9種主要海水養(yǎng)殖貝類,包括雙殼綱貝類7種,腹足綱2種。使用PCR方法檢測這些貝類樣品AVNV攜帶情況,有5種貝類樣品可攜帶AVNV,說明AVNV在養(yǎng)殖貝類中宿主范圍分布較廣泛,包括:近江牡蠣、長牡蠣、蝦夷扇貝、翡翠貽貝和紫貽貝等;共有3種貝類樣品未檢測出AVNV陽性,包括海灣扇貝、皺紋盤鮑和黑鮑,但是受采樣地點、時間和樣品數(shù)量的限制,這些種類能否攜帶AVNV還需要進一步研究。

7、>　　奧爾森帕金蟲(Perkinsus olseni,P.olseni)是重要的貝類病原性寄生蟲之一,為建立快速、準(zhǔn)確、靈敏和使用簡便的檢測方法,本文根據(jù)P.olseni5.8S rDNA中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)序列,使用在線設(shè)計軟件Primer Explorer V4設(shè)計一套P.olseni LAMP引物,建立了環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal

8、amplification,LAMP)檢測方法,并對反應(yīng)條件進行優(yōu)化,最終確立P.olseni的25 uL L,AMP反應(yīng)體系,且最佳反應(yīng)溫度為64℃,最佳反應(yīng)時間為60 min。本文根據(jù)P.olseni5.8S rDNA ITS序列構(gòu)建陽性質(zhì)粒,驗證了該方法檢測靈敏度約為30拷貝,且特異性良好,與海水帕金蟲(Perkinsusmarinus)、包納米蟲(Bonamia exitiosa)、波豆蟲(Ichthyobodo sp.)及AV