嵌合動(dòng)脈炎病毒構(gòu)建及其病毒學(xué)特性.pdf

1、1996年成立的動(dòng)脈炎病毒科(Arteriviridae)其成員包括：馬動(dòng)脈炎病毒(equine arteritis virus，EAV)，豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)乳酸脫氫酶升高病毒(lactate dehydrogenase-elevating virus，LDV)，猴出血熱病毒(simianhemorrhagic

2、fever virus，SHFV)。動(dòng)脈炎病毒感染動(dòng)物后能引起從無(wú)臨床癥狀的持續(xù)性感染到致死的急性感染不等的病征。其中PRRSV感染豬引起所謂的“豬藍(lán)耳病”給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前涉及到動(dòng)脈炎病毒復(fù)制過(guò)程的分子機(jī)制，尤其是囊膜蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系還不清楚。在本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)擁有的PRRSV和EAV全長(zhǎng)感染性克隆的基礎(chǔ)上，本研究利用反向遺傳操作方法對(duì)動(dòng)脈炎病毒的囊膜蛋白功能、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等進(jìn)行了解析，促進(jìn)了對(duì)動(dòng)脈炎病毒的進(jìn)一步了解，

3、為防治PRRSV及其它動(dòng)脈炎病毒奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
　　 1.不同基因型PRRSV嵌合體的構(gòu)建及其病毒學(xué)特性
　　 PRRSV分為兩個(gè)基因型，基因1型與基因2型，兩型之間基因相似性僅為60％左右。對(duì)本實(shí)驗(yàn)室擁有的1型PRRSV株vSHE與2型PRRSV株vAPRRSV進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)其囊膜蛋白GP2a、E、GP3、GP4、GP5之間的相似性在53-76％之間。以2型PRRSV的全長(zhǎng)感染性克隆pAPRRS為骨架，先將Asc

4、Ⅰ酶切位點(diǎn)插入ORF1b與ORF2a之間構(gòu)建全長(zhǎng)克隆pAPRRSase。再以pAPRRSasc為骨架，將其ORF2-3、ORF2-4、ORF2-5、ORF5分別替換為vSHE的相應(yīng)區(qū)域，構(gòu)建了全長(zhǎng)嵌合克隆pAPRRS-SHE23、pAPRRS-SHE234、pAPRRS-SHE2345、pAPRRS-SHE5。用如上構(gòu)建的嵌合克隆和pAPRRSasc轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞，除pAPRRS-SHE23以外均拯救出了相應(yīng)的感染性子病毒，分

5、別為vAPRRSasc、vAPRRS-SHE234、vAPRRS-SHE2345、vAPRRS-SHE5。間接免疫熒光(IFA)和全長(zhǎng)序列測(cè)定結(jié)果證實(shí)了子病毒的嵌合基因組結(jié)構(gòu)。將拯救病毒在體外連續(xù)傳代至第8代后測(cè)序表明嵌合病毒有很好的基因穩(wěn)定性。用能特異性識(shí)別1型PRRSV囊膜蛋白的抗體進(jìn)行IFA分析表明1型PRRSV基因能在2型骨架PRRSV中有效表達(dá)。對(duì)拯救出的嵌合病毒進(jìn)行病毒學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)：除vAPRRS-SHE5外其它嵌合病毒能

6、在MARC-145上形成與骨架親本病毒vAPRRS相似的空斑形態(tài)；所有嵌合病毒在MARC-145上的復(fù)制能力與親本病毒相似。這表明1型PRRSV的相應(yīng)囊膜蛋白能在2型PRRSV中發(fā)揮相同的功能。采用RT-PCR方法和特異性引物對(duì)，從病毒感染細(xì)胞的總RNA中擴(kuò)增出各個(gè)亞基因組mRNA(subgenomic mRNA，sgmRNA)。序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)：雖然兩型PRRSV位于結(jié)構(gòu)蛋白基因中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(body transcriptionreg

7、ulation sequence，TRS-B)不一致，但是1型TRS-B能與2型的位于5’UTR中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(leader transcription regulation sequence，TRS-L)互相作用形成相應(yīng)的雜合sg mRNA；由于1型TRS-B與2型TRS-L堿基之間的不精確配對(duì)導(dǎo)致基因組中一些TRS-B類似序列發(fā)揮作用，產(chǎn)生了一些比經(jīng)典sg mRNA小的亞基因組RNA(sg RNA)。本研究首次獲得了不同基因型PR

8、RSV嵌合的感染性子病毒，闡明了1型PRRSV的囊膜蛋白能在2型PRRSV中發(fā)揮功能，從理論上表明兩型PRRSV之間可能發(fā)生重組。這為進(jìn)一步研究PRRSV囊膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系、開(kāi)發(fā)基因標(biāo)記疫苗奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 2.不同種動(dòng)脈炎病毒嵌合體的構(gòu)建及其病毒學(xué)特性
　　 目前對(duì)動(dòng)脈炎病毒細(xì)胞受體和病毒結(jié)合蛋白的認(rèn)識(shí)還沒(méi)有統(tǒng)一，大部分人認(rèn)為病毒結(jié)合蛋白是多量囊膜糖蛋白GP5，而有人提出可能是少量囊膜蛋白。這些結(jié)論都是基于

9、體外的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)得到，缺乏遺傳學(xué)和病毒學(xué)上的證據(jù)。已知在體外PRRSV只能感染MARC-145細(xì)胞，而EAV能感染MARC-145、BHK-21、Vero等多種細(xì)胞。在本項(xiàng)研究中，以上一項(xiàng)研究構(gòu)建的全長(zhǎng)感染性克隆pAPRRSasc為骨架，分別將其ORF2-4、ORF5替換為EAV的相應(yīng)區(qū)域構(gòu)建全長(zhǎng)嵌合克隆pAPRRS-EAV234、pAPRRS-EAV5。用構(gòu)建的嵌合克隆轉(zhuǎn)染MARC-145，發(fā)現(xiàn)克隆pAPRRS-EAV234能拯救出

10、感染性的子病毒vAPRRS-EAV234。通過(guò)IFA和全長(zhǎng)序列測(cè)序分析證實(shí)了vAPRRS-EAV234的嵌合基因組結(jié)構(gòu)。對(duì)第8代病毒測(cè)序表明嵌合病毒在體外具有很好的基因穩(wěn)定性。用特異性識(shí)別EAV GP2b的抗體對(duì)vAPKRS-EAV234感染細(xì)胞進(jìn)行IFA分析表明嵌入基因能在PRRSV骨架中有效表達(dá)。病毒學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)：嵌合病毒vAPRRS-EAV234獲得了供體親本病毒EAV的細(xì)胞感染譜，除了能感染除MARC-145外還能感染BHK-

11、21和Vero細(xì)胞，但不能感染骨架親本病毒PRRSV的體內(nèi)靶細(xì)胞-豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)；vAPRRS-EAV234能在MARC-145和BHK-21上實(shí)現(xiàn)良好的增殖，其在BHK-21上的最高病毒滴度為在MARC-145上的10倍。對(duì)vAPRRS-EAV234的sg mRNA轉(zhuǎn)錄譜和sg mRNA序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：雖然EAV和PRRSV的TRS序列差距很大，但是EAV的TRS-B可以與PRRSV的TRS-L結(jié)合；由于EAV的TRS-B

12、與PRRSV的TRS-L之間的不精確配對(duì)導(dǎo)致sg mRNA2-4的轉(zhuǎn)錄量明顯下降；產(chǎn)生了一系列具有潛在編碼價(jià)值的新sg RNA，這些sg RNA的意義還未知。本研究不但在世界上首次成功獲得了不同種動(dòng)脈炎病毒之間完整ORF替換的具有感染性的嵌合病毒，更重要的是首次從遺傳學(xué)和病毒學(xué)的角度闡明少量囊膜蛋白在動(dòng)脈炎病毒侵入細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮決定性作用。該研究同時(shí)提供了一種生產(chǎn)高滴度PRRSV的方法，極有利于疫苗生產(chǎn)。
　　 3.插入嵌合體動(dòng)

13、脈炎病毒的構(gòu)建及其病毒學(xué)特性
　　 上一項(xiàng)的研究表明EAV的ORF2-4可以在PRRSV中穩(wěn)定存在并發(fā)揮功能，且已知另外一個(gè)動(dòng)脈炎病毒SHFV基因組中擁有2套ORF2-4。該項(xiàng)研究在以上研究基礎(chǔ)上以全長(zhǎng)感染性克隆pAPRRSasc為骨架，將EAV的ORF2-4插入ORF1b和ORF2a之間，構(gòu)建了嵌合克隆pAPRRS(EAV234)。用該克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞拯救出了具有感染性的插入嵌合病毒vAPRRS(EAV234)。IFA和核酸序列測(cè)

14、定結(jié)果均證實(shí)了子病毒的基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)且插入基因能有效表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)vAPRRS(EAV234)在EAV ORF2-4穩(wěn)定存在的同時(shí)PRRSV自身的ORF2-4卻發(fā)生大范圍的缺失。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)插入嵌合病毒vAPRRS(EAV234)能感染MARC-145和BHK-21細(xì)胞。本研究表明：PRRSV乃至其它動(dòng)脈炎病毒可以容納2套少量囊膜蛋白基因，但是穩(wěn)定性不強(qiáng)；作為一種潛在外源基因載體，PRRSV可以在ORF1b和ORF2a之間插入較大的外源基