橘小實(shí)蠅RNAi及其對(duì)RNAi的免疫耐受機(jī)制研究.pdf

1、RNAi是由dsRNA引發(fā)的，靶向切割mRNA的高效特異的基因沉默技術(shù)。由于該技術(shù)具有高效性和便捷性，因此RNAi技術(shù)在包括基因功能研究、高通量靶標(biāo)基因篩選、基因治療、藥物靶標(biāo)預(yù)測和農(nóng)業(yè)病蟲害防治等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。RNAi實(shí)現(xiàn)方式包括顯微注射、浸泡和飼喂法。雖然RNAi是一種廣泛存在于多種真核生物并高度保守的機(jī)制，但是RNAi的應(yīng)用仍然面對(duì)很多問題，例如包括許多雙翅目昆蟲在內(nèi)的部分物種中RNAi難以實(shí)現(xiàn)和RNAi效應(yīng)持續(xù)時(shí)間較短等。橘

2、小實(shí)蠅的RNAi研究目前尚屬空白。橘小實(shí)蠅是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，為害250多種蔬果。本研究以橘小實(shí)蠅為研究對(duì)象，建立橘小實(shí)蠅的飼喂法RNAi體系;利用RNAi技術(shù)研究橘小實(shí)蠅spr基因和共生病毒功能;首次發(fā)現(xiàn)了橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi的免疫耐受現(xiàn)象并闡述其機(jī)制。
　　1.成功建立了橘小實(shí)蠅飼喂法RNAi體系。直接喂食靶標(biāo)基因dsRNA和喂食表達(dá)靶標(biāo)基因dsRNA的大腸桿菌均可以實(shí)現(xiàn)目的基因沉默。其中rpl19 dsRNA喂食組橘小實(shí)蠅r

3、pl19基因表達(dá)量在喂食后第1天和第7天分別出現(xiàn)了89％和85％的下調(diào)。在表達(dá)rpl19 dsRNA大腸桿菌喂食組中，rpl19基因表達(dá)水平于第1天和第7天出現(xiàn)了30％的下調(diào)。在V-A TP-D dsRNA喂食組中，V-A TP-D基因表達(dá)水平在第4天出現(xiàn)了幅度為36％下調(diào)。在表達(dá)V-A TP-D dsRNA的大腸桿菌喂食組中，V-A TP-D基因表達(dá)水平在第4天出現(xiàn)了50％的下調(diào)。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)基因在飼喂dsRNA和表達(dá)dsRNA的

4、菌液后于第2天或第4天出現(xiàn)了上調(diào)。rpl19 dsRNA喂食組橘小實(shí)蠅rpl19基因表達(dá)量在喂食后第4天出現(xiàn)了3倍的上調(diào)。在表達(dá)V-A TP-D dsRNA的大腸桿菌喂食組中，V-A TP-D基因表達(dá)水平在第2天出現(xiàn)了1.6倍的上調(diào)。組織特異性檢測結(jié)果表明飼喂法RNAi所引起的RNAi不局限于中腸，可以在頭、生殖系統(tǒng)和脂肪體中觀察到。其中，noa dsRNA喂食RNAi導(dǎo)致noa基因表達(dá)水平于生測后第2天在頭、卵巢、精巢和脂肪體中分別出

5、現(xiàn)了64％、23％、95％和89％的下調(diào)。連續(xù)喂食rpl19 dsRNA12天后，rpl19基因表達(dá)水平恢復(fù)到正常，與egfp dsRNA喂食組無顯著差異。同時(shí)，使用500ng/μl、100ng/μl和10ng/μl rpl19 dsRNA進(jìn)行橘小實(shí)蠅喂食RNAi實(shí)驗(yàn)均觀察到rpl19基因表達(dá)水平于12天后恢復(fù)至正常水平。使用羽化后5天和羽化后10天橘小實(shí)蠅進(jìn)行的rpl19 dsRNA喂食實(shí)驗(yàn)也觀察到這一現(xiàn)象。上述結(jié)果表明這一現(xiàn)象與生測

6、所用橘小實(shí)蠅的蟲齡以及生測使用的dsRNA濃度無關(guān)。對(duì)F2代成蟲RNAi效應(yīng)檢測結(jié)果表明親代的RNAi干擾對(duì)子代沒有影響。對(duì)子代初羽化成蟲進(jìn)行的rpl19 dsRNA喂食實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rpl19基因表達(dá)水平下調(diào)了66％，與親代未經(jīng)RNAi處理的F2代成蟲喂食RNAi結(jié)果一致。
　　2.我們首次發(fā)現(xiàn)橘小實(shí)蠅可以對(duì)RNAi產(chǎn)生免疫耐受并闡述了其機(jī)制。第一次喂食rpl19 dsRNA的RNAi導(dǎo)致rpl19基因下調(diào)66％;在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的

7、第二次喂食rpl19 dsRNA的RNAi無法引起rpl19基因下調(diào)。結(jié)果表明第一次針對(duì)內(nèi)源基因的RNAi可以使橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi產(chǎn)生免疫耐受現(xiàn)象。同時(shí)這種免疫耐受現(xiàn)象是非基因特異的。第一次喂食rpl19 dsRNA的RNAi同樣使橘小實(shí)蠅對(duì)第二次喂食spr dsRNA的RNAi產(chǎn)生免疫，spr表達(dá)水平在第二次RNAi中不出現(xiàn)下調(diào)。1000ng/μl rpl19dsRNA引起的橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi的免疫耐受性持續(xù)20-30天;100ng/

8、μl和10ng/μlrpl19 dsRNA引起的橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi的免疫耐受性分別持續(xù)10-20天和5天，表明橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi的免疫耐受性的持續(xù)時(shí)間和第一次RNAi中所使用的dsRNA濃度相關(guān)。通過巴弗洛霉素處理橘小實(shí)蠅腸道，我們發(fā)現(xiàn)橘小實(shí)蠅的dsRNA攝取是由胞吞機(jī)制調(diào)控的。熒光免疫染色研究結(jié)果表明在對(duì)RNAi免疫耐受的橘小實(shí)蠅中，dsRNA攝取機(jī)制受到了阻遏，dsRNA無法正常進(jìn)入細(xì)胞。在對(duì)RNAi免疫耐受的橘小實(shí)蠅中，chc、l

9、ight、cog3、ap50和ninac等基因均出現(xiàn)了30％-60％的下調(diào)，表明其對(duì)RNAi的免疫耐受性是由胞吞機(jī)制的活性下降所引起的。這一結(jié)論也得到了高通量測序結(jié)果的支持。高通量測序發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞運(yùn)輸?shù)腸hc、actin1、actin2和actin5等基因出現(xiàn)下調(diào)。而通過利用雙氧水促進(jìn)肌動(dòng)蛋白形成可以解除橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi的免疫耐受。5％的H2O2與100ng/μl rpl19 dsRNA共喂食引起對(duì)RNAi免疫耐受的橘小實(shí)蠅中rpl1

10、9基因表達(dá)水平出現(xiàn)50％的下調(diào)。這些研究結(jié)果證實(shí)了胞吞機(jī)制受阻是橘小實(shí)蠅對(duì)RNAi產(chǎn)生免疫耐受現(xiàn)象的關(guān)鍵原因。
　　3.通過上述建立的RNAi技術(shù)發(fā)現(xiàn)spr參與了橘小實(shí)蠅交配后抗氧化脅迫能力的改變。通過克隆獲取橘小實(shí)蠅spr基因全長，該基因編碼324個(gè)氨基酸。cDNA序列十分保守，與地中海實(shí)蠅spr相似度為86％（E值=0）。spr表達(dá)模式結(jié)果顯示spr在中腸中表達(dá)量最高，其次為后腸和頭部。spr在不同發(fā)育階段的橘小實(shí)蠅中均有表達(dá)

11、，其中在幼蟲和蛹期表達(dá)水平最高。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)橘小實(shí)蠅交配后雌蟲的抗氧化脅迫能力下降。在雙氧水生測中，交配后的雌蟲存活率明顯低于未交配雌蟲，生測開始后72小時(shí)的交配組雌蟲存活率為9.4％，在同一時(shí)間點(diǎn)，未交配雌蟲存活率為56.7％(p=0.017)。同時(shí)交配后TOR信號(hào)通路的rheb基因上調(diào)了88％、tor基因上調(diào)了28％。此外，TOR通路的關(guān)鍵效應(yīng)基因s6k上調(diào)了54％，表明橘小實(shí)蠅對(duì)氧化脅迫敏感性上升;而通過顯微注射spr dsRNA

12、，成功敲除spr，使spr基因表達(dá)水平下調(diào)了75％后，橘小實(shí)蠅交配后抗氧化脅迫能力不變，TOR通路基因的表達(dá)水平也未發(fā)生變化。這些結(jié)果表明spr通過TOR通路參與了橘小實(shí)蠅交配后抗氧化脅迫能力的改變。
　　4.利用RNAi技術(shù)研究橘小實(shí)蠅共生病毒的功能。根據(jù)DGE和轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，我們鑒定了8個(gè)橘小實(shí)蠅共生病毒序列。其中contig1697、contig475、comp2791和comp11365編碼雙順反子病毒科病毒的結(jié)構(gòu)蛋白或

13、者非結(jié)構(gòu)蛋白。comp3227和comp16524編碼RdRp聚合酶，屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)。我們利用comp11365病毒RdRp序列確認(rèn)其分類地位為小RNA病毒目(Picornavirales)、雙順反子病毒科（Dicistroviridae）、蟋蟀麻痹病毒屬(Cripavirus)，并將其命名為Bdv-1。Bdv-1病毒主要分布于橘小實(shí)蠅中腸，其含量為生殖系統(tǒng)的3000倍。使用飼喂法干擾Bdv-1表達(dá)后，我們