KLF14基因表達(dá)改變對肝胰島素抵抗及其相關(guān)信號通路的影響.pdf

1、第一部分KLF14基因mRNA及蛋白在小鼠及人類代謝相關(guān)組織中的表達(dá)
　　目的:觀察KLF14基因mRNA及蛋白在C57BL/6J、HFD-C57BL/6J、db/db小鼠及正常人、T2DM患者代謝相關(guān)組織中的表達(dá)情況。
　　方法：提取小鼠肝臟、脂肪、肌肉組織及正常人、T2DM病人脂肪、肌肉組織的RNA和蛋白。RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后通過實時熒光定量PCR（real-time PCR）檢測KLF14基因mRNA在各組織

2、中的表達(dá)情況。采用Western blot檢測KLF14蛋白在各組織的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：KLF14 mRNA和蛋白在HFD-C57BL/6J、db/db小鼠肝臟、脂肪、肌肉組織中的表達(dá)明顯低于C57BL/6J（P<0.01）；而且在T2DM病人中脂肪和肌肉中 KLF14 mRNA和蛋白的表達(dá)也明顯低于正常人（P<0.01）。
　　結(jié)論: KLF14 mRNA和蛋白在 HFD-C57BL/6J、db/db小鼠及T2DM病人

3、代謝相關(guān)組織中表達(dá)明顯偏低，提示KLF14可能在代謝相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分 KLF14基因表達(dá)變化對胰島素信號通路中信號分子的影響
　　目的:探討KLF14基因過表達(dá)對PI3K/Akt信號通路中關(guān)鍵信號分子的影響。
　　方法：采用pIRES2-KLF14質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hepa1-6細(xì)胞建立KLF14過表達(dá)模型。利用[3H]-2-脫氧-D-葡萄糖攝取法檢測Hepa1-6細(xì)胞對葡萄糖的攝取作用；采用Western

4、 blot檢測PI3K/Akt信號通路中p-InsR/InsR、p-IRS1/IRS1、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：在胰島素（100nM）刺激下，KLF14過表達(dá)明顯上調(diào)細(xì)胞葡萄糖攝取率（P<0.05），p-InsR、p-IRS1、p-Akt、p-GSK3β的磷酸化水平顯著增強(qiáng)（P<0.05或P<0.01）。給予PI3K抑制劑（LY294002）作用后，細(xì)胞葡萄糖攝取率及p-Akt、p

5、-GSK3β的磷酸化水平明顯下降（P<0.01）。
　　結(jié)論：KLF14可能通過激活胰島素經(jīng)典通路——PI3K/Akt信號通路增加胰島素敏感性，改善肝細(xì)胞胰島素抵抗。
　　第三部分 KLF14基因過表達(dá)改善肝細(xì)胞胰島素抵抗及其相關(guān)機(jī)制研究
　　目的：探討KLF14基因過表達(dá)改善肝細(xì)胞胰島素抵抗及其可能的分子機(jī)制研究
　　方法：采用一定高濃度胰島素和（或）葡萄糖作用于Hepa1-6小鼠肝癌細(xì)胞，構(gòu)建肝細(xì)胞胰島素抵抗

6、模型；采用MTT法檢測細(xì)胞活率；運用KLF14過表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-KLF14上調(diào)肝細(xì)胞KLF14表達(dá)；采用[3H]-2-脫氧-D-葡萄糖攝取法檢測Hepa1-6細(xì)胞對葡萄糖的攝取作用；采用Western blot檢測胰島素信號通路中p-Akt/Akt蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：給予Hepa1-6細(xì)胞高濃度胰島素（10-8M）、葡萄糖（25mM）作用24小時，Hepa1-6細(xì)胞葡萄糖攝取率及p-Akt表達(dá)明顯下降（P<0.01）;

7、然而，在胰島素（100nM）刺激下，將細(xì)胞KLF14基因表達(dá)上調(diào)可明顯改善高濃度胰島素和（或）高濃度葡萄糖作用引起的葡萄糖攝取率及p-Akt表達(dá)下降（P<0.05或 P<0.01），而在給予細(xì)胞PI3K抑制劑（LY294002）之后，葡萄糖攝取率及p-Akt水平明顯降低（P<0.05 or P<0.01）。另外，采用正常人及T2DM病人血清分別作用Hepa1-6細(xì)胞24小時，在胰島素（100nM）刺激下，T2DM病人血清可使細(xì)胞葡萄糖糖