新基因KLF14過表達影響肝糖代謝及胰島素抵抗的機制研究.pdf

1、本文從以下幾部分進行了論述。
　　第一部分小鼠KLF14基因真核過表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定。
　　目的:構(gòu)建及鑒定小鼠pIRES2-EGFP-KLF14真核過表達載體。
　　方法:首先從小鼠組織提取總RNA，通過RT-PCR的方法獲取目的DNA，再經(jīng)膠回收、純化、雙酶切以及與過表達載體pIRES2-EGFP連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-KLF14，最后利用雙酶切以及DNA測序?qū)χ亟M質(zhì)粒進行鑒定。
　　結(jié)果

2、:重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，成像顯示兩條帶，大片段約5.3Kb（pIRES2-EGFP線性化質(zhì)粒）和小片段約1000bp（KLF14的PCR產(chǎn)物），初步鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。DNA測序結(jié)果經(jīng)BLAST進行序列分析，結(jié)果顯示其核酸序列與GenBank中小鼠KLF14基因的CDS區(qū)序列完全一致，進一步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了小鼠pIRES2-EGFP-KLF14真核過表達質(zhì)粒，為后續(xù)細胞實驗研究KLF1

3、4過表達對糖代謝以及胰島素抵抗的影響提供技術手段和奠定堅實基礎。
　　第二部分KLF14基因mRNA在小鼠各組織的分布情況分析。
　　目的:觀察轉(zhuǎn)錄水平上KLF14基因在健康C57BL/6J小鼠體內(nèi)各組織的表達分布情況。
　　方法:將小鼠頸椎脫臼處死后，首先取其多處組織如心臟、肝臟、腎臟、腦、脾臟、肺、胃、腸、附睪、骨骼肌、脂肪，并提取各組織RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA;然后通過實時熒光定量PCR(real-timeP

4、CR)的方法，檢測KLF14基因mRNA在各組織的表達分布情況，實驗重復三次。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)錄水平上KLF14基因在小鼠體內(nèi)普遍表達，其mRNA相對表達量由高到低依次為心臟、骨骼肌、肝臟、脂肪、小腸、腎臟、腦、肺、胃、脾、附睪。
　　結(jié)論:KLF14基因在小鼠體內(nèi)普遍表達，其中心臟、骨骼肌、肝臟等組織的相對表達量較高，為探討KLF14在糖代謝中的調(diào)控作用，我們選擇肝細胞作為體外研究對象，以進一步研究KLF14的生理功能。

5、r>　　第三部分KLF14基因過表達對相關信號通路中關鍵信號分子的影響研究。
　　目的:觀察KLF14過表達對InsR/IRS/AKT/GSK-3β以及AMPK/TORC2/PEPCK信號通路中關鍵信號分的影響，探討KLF14影響糖代謝以及胰島素抵抗的分子生物學機制。
　　方法:建立KLF14過表達的體外研究肝癌細胞模型，分組（空白對照組、INS處理組、KLF14轉(zhuǎn)染組和INS+KLF14處理組）并分別加以處理，然后采用we

6、stern blot的方法，檢測KLF14對兩條信號通路中關鍵信號分子的影響。采用[3H]-2-脫氧-D-葡萄糖攝取法檢測肝癌細胞對葡萄糖的攝取率。
　　結(jié)果:INS處理hepa1-6小鼠肝癌細胞后，KLF14轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比，除p-InsR表達無明顯改變外，其他指標如p-IRS、p-AKT、p-AMPK、p-TORC2表達均明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01):另外，糖原合成關鍵酶p-GSK3β表達亦明顯增加，而糖異