KLF14基因在心肌肥厚中表達(dá)和功能的初步研究.pdf

1、第一部分：KLF14基因在心肌肥厚表達(dá)和功能的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究
　　【研究目的】
　　心肌肥厚是心臟對(duì)慢性壓力或容量超負(fù)荷產(chǎn)生的一種代償反應(yīng)，它的基本變化包括心肌細(xì)胞的肥大和非心肌細(xì)胞的增殖、增生[1-2]。本部分首先構(gòu)建KLF14腺病毒，通過(guò)異丙腎上腺素（Isoprenaline,ISO）刺激體外培養(yǎng)的新生大鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞建立肥大模型，然后通過(guò)用KLF14腺病毒轉(zhuǎn)染新生大鼠原代心肌細(xì)胞，觀察相關(guān)指標(biāo)的變化，探討KLF14基

2、因在心肌細(xì)胞中的表達(dá)情況，探討KLF14過(guò)表達(dá)在心肌細(xì)胞肥大的功能，為研究KLF14在動(dòng)物心肌肥厚中的功能打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　【研究方法】
　　1．大鼠KLF14腺病毒構(gòu)建
　　1.1大鼠腺病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建
　　在NCBI中查詢到大鼠KLF14基因序列，并據(jù)此人工合成kLF14對(duì)應(yīng)的基因組片段。配制BamHI和EcoRI雙酶切體系，分別酶切pHBAd-MCMV-RFP載體和KLF14基因并膠回收。取2ul處理好

3、的酶切后KLF14片段，100-200ng酶切后載體，2ulligasebuffer，1ulT4ligase，加滅菌雙蒸水至20ul配成連接液16℃過(guò)夜得到pHBAd-MCMV-RFP-KLF14重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和測(cè)序后通過(guò)大腸桿菌擴(kuò)增。
　　1.2KLF14腺病毒包裝及滴度測(cè)定
　　用pHBAd-MCMV-RFP-KLF14重組質(zhì)粒和pHBAd-BHG骨架質(zhì)粒，在293細(xì)胞中包裝成pHBAd-MCMV-RFP

4、-KLF14腺病毒。大量擴(kuò)增后收毒，測(cè)定陰性對(duì)照RFP腺病毒和KLF14腺病毒滴度，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　2．心肌細(xì)胞肥大時(shí)，KLF14表達(dá)及功能研究
　　采用體外心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)出生1-3天的SD乳鼠心肌細(xì)胞，用ISO刺激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大模型。設(shè)立對(duì)照組（給予滅菌蒸餾水）及不同刺激時(shí)間的ISO刺激組。采用RT-PCR法比較各組細(xì)胞間KLF14mRNA、BNPmRNA的表達(dá)變化情況。
　　3．KLF1

5、4過(guò)表達(dá)在心肌細(xì)胞肥大中的功能研究
　　3.1原代培養(yǎng)新生SD大鼠心肌細(xì)胞，48h后轉(zhuǎn)染不同感染倍數(shù)（MOI）KLF14表達(dá)腺病毒，使用流式細(xì)胞儀及CCK8，檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染率及活力情況以選擇合適轉(zhuǎn)染倍數(shù)。
　　3.2設(shè)置以下分組：①KLF14腺病毒組②KLF14腺病毒+ISO組③RFP腺病毒組④RFP腺病毒+ISO組。采用RT-PCR檢測(cè)各組BNPmRNA及KLF14mRNA的表達(dá)變化情況。
　　【結(jié)果】
　　1.

6、成功構(gòu)建pHBAd-MCMV-RFP-KLF14過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，聯(lián)合骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后得pHBAd-MCMV-RFP-KLF14腺病毒，293T細(xì)胞中的腺病毒拍照呈紅色熒光。改進(jìn)的TCID50法計(jì)算，構(gòu)建的pHBAd-MCMV-RFP腺病毒滴度2×1010PFU/ml，pHBAd-MCMV-RFP-KLF14腺病毒滴度1×1010PFU/ml。
　　2.流式細(xì)胞學(xué)檢查，KLF14腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。綜合

7、考慮KLF14腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率和CCK8檢測(cè)腺病毒對(duì)心肌細(xì)胞活力影響，轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞時(shí)，我們選擇KLF14腺病毒的MOI=20，RFP腺病毒的MOI=10。
　　3.KLF14在SD乳鼠心肌細(xì)胞中低豐度表達(dá)。用ISO刺激心肌細(xì)胞30分鐘，KLF14基因表達(dá)量開(kāi)始升高，以4h為最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；刺激24h后KLF14的表達(dá)量下降至對(duì)照組水平，與對(duì)照組無(wú)明顯差異。
　　4單純ISO刺激組較對(duì)照組的B

8、NPmRNA明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。.單純轉(zhuǎn)染KLF14腺病毒較單純轉(zhuǎn)染RFP腺病毒BNPmRNA較對(duì)照組無(wú)明顯變化。KLF14腺病毒聯(lián)合ISO刺激組較單純ISO刺激組（P＜0.05）和RFP腺病毒聯(lián)合ISO刺激組中（P＜0.05）BNPmRNA明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　【結(jié)論】生理情況下，KLF14在心肌細(xì)胞中低豐度表達(dá)。在心肌細(xì)胞病理性肥大情況下表達(dá)升高，轉(zhuǎn)染腺病毒表達(dá)載體使KLF14在乳鼠心肌細(xì)胞

9、中過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大加重。
　　第二部分KLF14基因在心肌肥厚中表達(dá)和功能的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　【研究目的】
　　第一部分實(shí)驗(yàn)明確KLF14基因過(guò)表達(dá)促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的作用以后，因心肌細(xì)胞僅是心肌的部分成分，心肌還含有成纖維細(xì)胞等非心肌細(xì)胞，另外機(jī)體內(nèi)有復(fù)雜的神經(jīng)體液調(diào)節(jié)機(jī)制，因此還需要整體實(shí)驗(yàn)來(lái)研究KLF14基因在動(dòng)物心肌肥厚中的表達(dá)和功能。本部分皮下埋置預(yù)裝ISO的微滲透泵刺激小鼠建立小鼠心肌肥

10、厚模型，KLF14轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)現(xiàn)KLF14過(guò)表達(dá)，通過(guò)與對(duì)照組小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠在超聲心動(dòng)圖，心室組織切片HE染色、WGA染色及RT-PCR時(shí)KLF14mRNA等指標(biāo)變化情況，探討KLF14基因在動(dòng)物心肌肥厚中的表達(dá)和功能情況。
　　【研究方法】
　　1.小鼠心肌肥厚模型的建立
　　野生型FVB小鼠隨機(jī)分成兩組，ISO組皮下埋置預(yù)裝ISO微泵，PBS對(duì)照組皮下埋置預(yù)裝等量PBS的微泵，按30mg/kg/d劑量刺激14

11、天，行超聲心動(dòng)圖及心室組織切片HE染色、WGA染色情況了解心肌肥厚模型是否成立，比較ISO組和PBS組的KLF14mRNA表達(dá)情況。
　　2.KLF14在心臟過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致心肌肥厚
　　KLF14轉(zhuǎn)基因FVB小鼠與野生型FVB小鼠喂食相同的水和飼料，12月后處死后提取心室組織RNA行RT-PCR比較兩組KLF14mRNA表達(dá)水平。行超聲心動(dòng)圖檢查、心室組織切片HE染色、WGA染色了解心室肥厚情況。
　　【結(jié)果】
　

12、　1.KLF14在正常心肌組織中低豐度表達(dá)。
　　2.與PBS對(duì)照組相比，14天后埋泵組ISO組M型超聲心動(dòng)圖下左心室收縮后壁厚度（LVPWs）、左心室舒張后壁厚度（LVPWd）、左心室收縮前壁厚度（LVAWs）增加（p＜0.05），心室組織切片HE染色示心肌組織增厚，左心室腔變小，心臟出現(xiàn)向心性肥厚，WGA染色示心肌細(xì)胞膜表面積增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：說(shuō)明小鼠心肌肥厚模型造模成功。RT-PCR結(jié)果ISO組KLF14mRNA表達(dá)量

13、上升，提示心肌肥厚時(shí)KLF14表達(dá)量上調(diào)。
　　3.提取小鼠心室組織RNA行RT-PCR,與野生型組小鼠相比，KLF14轉(zhuǎn)基因組小鼠較野生型組小鼠KLF14mRNA表達(dá)量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。KLF14轉(zhuǎn)基因小鼠較野生型小鼠超聲心動(dòng)圖、心肌組織切片HE染色示心肌組織增厚，左心室腔變小，心臟出現(xiàn)向心性肥厚，WGA染色示心肌細(xì)胞膜表面積增大，提示KLF14基因過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠產(chǎn)生一種類似皮下埋置預(yù)裝ISO微泵的功能，