NIS作為報告基因在心肌細胞中特異表達的研究.pdf

1、本文對NIS作為報告基因在心肌細胞中特異表達進行了研究。本研究分為兩個部分：
　　 第一部分：
　　 目的：構(gòu)建肌凝蛋白輕鏈蛋白-2（mlc-2v）啟動子調(diào)控的人鈉碘同向轉(zhuǎn)運體（hNIS）的腺病毒載體，探討NIS作為報告基因檢測目的基因在心肌細胞中特異性表達的可行性。
　　 方法：將mlc-2v啟動子和hNIS基因亞克隆至腺病毒穿梭載體，再與含有骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183同源重組，經(jīng)HEK2

2、93細胞包裝并擴增得到重組腺病毒Ad-mlc-NIS，同時構(gòu)建巨細胞病毒(CMV)啟動子調(diào)控的腺病毒Ad-cmv-NIS，僅含有啟動子的腺病毒Ad-mlc和僅含有NIS基因片段的腺病毒Ad-NIS作為對照組。腺病毒體外感染H9C2（大鼠心肌細胞）、A549(人肺腺癌細胞)和U87(人腦膠質(zhì)瘤細胞)，通過Western blot檢測NIS蛋白的表達，動態(tài)攝碘及NaClO4攝碘抑制實驗觀察表達的NIS蛋白的功能和特性；臺盼藍染色實驗檢測腺病

3、毒及其NIS攝碘對心肌細胞活力和增殖的影響。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了重組NIS腺病毒，受不同啟動子調(diào)控。重組腺病毒Ad-mlc-NIS和Ad-cmv-NIS分別感染心肌細胞系（H9C2細胞）和非心肌細胞系（A549細胞和U87細胞），Western blot示感染Ad-cmv-NIS的細胞中心肌細胞系（H9C2）和非心肌細胞系（A549和U87）均出現(xiàn)NIS蛋白的高表達。感染Ad-mlc-NIS的細胞，在非心肌細胞系中出現(xiàn)了微量

4、蛋白表達，在心肌細胞NIS蛋白的高表達。動態(tài)攝碘顯示感染Ad-mlc-NIS的心肌細胞攝碘約為對照組的10倍且能被NaClO4抑制，而對照組沒有明顯的攝碘功能；感染Ad-cmv-NIS的心肌細胞攝碘峰值較感染Ad-mlc-NIS的心肌細胞攝碘峰值低。臺盼藍染色實驗示在此實驗條件下腺病毒感染和攝碘對心肌細胞活力和增殖的影響較小。
　　 結(jié)論：肌凝蛋白輕鏈蛋白-2（mlc-2v）啟動子調(diào)控的腺病毒載體可使外源基因NIS在心肌細胞內(nèi)特

5、異性表達，NIS基因作為報告基因可以有效的檢測目的基因的表達，為進一步NIS作為報告基因監(jiān)測治療基因的表達實驗奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分：
　　 目的：通過引入內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)序列,構(gòu)建含有血管內(nèi)皮生長因子（VEGF165）和人鈉碘同向轉(zhuǎn)運體（hNIS）的真核分泌穿梭載體pIRES-VEGF-NIS。體外檢測NIS蛋白和VEGF蛋白在HEK293和H9C2細胞中的表達，探討NIS作為報告基因監(jiān)測VEGF1

6、65治療基因表達的可行性。
　　 方法：PCR方法擴增得到目的基因hNIS和VEGF165通過酶切連接亞克隆至pIRES載體獲得pIRES-VEGF-NIS質(zhì)粒。將IRES-VEGF-NIS片段亞克隆至質(zhì)粒pAdTRack-mlc質(zhì)粒，構(gòu)建好的質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293細胞，Western blot和免疫熒光檢測VEGF和NIS蛋白的表達。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了雙基因共表達載體pIRES-VEGF-NIS。分別受巨

7、細胞病毒(CMV)和肌凝蛋白啟動子（mlc-2v）啟動子調(diào)控，Western blot顯示兩種啟動子調(diào)控的VEGF蛋白和NIS蛋白均可以同時在H9C2細胞中表達，但是在293細胞中僅有CMV啟動子調(diào)控的蛋白表達。免疫熒光示轉(zhuǎn)染的細胞表達的VEGF蛋白位于胞漿，NIS蛋白位于細胞膜上。
　　 結(jié)論：IRES序列調(diào)控VEGF165與hNIS雙基因在細胞中可以同時獨立表達，且mlc-2v啟動子具有心肌特異性，為進一步構(gòu)建雙基因表達重組