短鏈?；o酶A脫氫酶在心肌細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的：
　　短鏈?；o酶A脫氫酶(Short-chain acyl-CoA dehydrogenase。SCAD)是脂肪酸氧化的關(guān)鍵酶，在心臟的發(fā)育發(fā)展中起著重要的作用。SCAD能夠特異性地分解底物短鏈酰基輔酶A，是脂肪酸β氧化中的第一個(gè)限速酶。本課題旨在研究 SCAD在心肌細(xì)胞凋亡中的變化，探討腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase。AMPK)/過氧化

2、物酶體增殖劑活化受體α(peroxisome proliferator-activated receptorα。PPARα)/SCAD信號途徑對心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，為確立SCAD作為心肌細(xì)胞凋亡的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide，tBHP)刺激原代心肌細(xì)胞，建立心肌細(xì)胞凋亡模型。檢測心肌細(xì)胞存活率和SCAD的mRNA、蛋白表達(dá)變化。
　　

3、2.采用SCAD最優(yōu)干擾序列siRNA-1186,檢測siRNA-1186刺激心肌細(xì)胞后，SCAD的表達(dá)量、酶活性的改變以及脂質(zhì)代謝的變化，同時(shí)檢測心肌細(xì)胞凋亡指標(biāo)，細(xì)胞存活率，細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡蛋白caspase3、Bcl-2、Bax的變化，并與tBHP誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡模型相比較。
　　3.采用 PPARα激動劑非諾貝特（Fenofibrate，F(xiàn)eno)(10μM)預(yù)處理30 min后，再以tBHP或siRNA-1186刺

4、激心肌細(xì)胞。檢測PPARα和 SCAD的mRNA、蛋白表達(dá)變化，SCAD酶活性變化，心肌細(xì)胞游離脂肪酸和 ATP含量變化，同時(shí)檢測心肌細(xì)胞凋亡指標(biāo)，細(xì)胞存活率，細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡蛋白caspase3、Bcl-2、Bax的變化。
　　4.采用AMPK激動劑AICAR(0.5mM)預(yù)處理30 min后，再以 tBHP刺激心肌細(xì)胞。檢測磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α（p-AMPKα）、PPARα和 SCAD的表達(dá)量變化，SCAD酶活性變化

5、，心肌細(xì)胞游離脂肪酸和 ATP含量變化，同時(shí)檢測心肌細(xì)胞凋亡指標(biāo)，細(xì)胞存活率，細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡蛋白caspase3、Bcl-2、Bax的變化。
　　結(jié)果：
　　1. MTT結(jié)果顯示：心肌細(xì)胞存活率隨tBHP濃度的變化和時(shí)間的延長呈依賴性下降，且在tBHP濃度為200μM，作用時(shí)間為6h時(shí)，細(xì)胞存活率為50％。Western Blot和RT-PCR結(jié)果顯示，在tBHP濃度為200μM，作用時(shí)間為6h和8h時(shí)，SCAD的表達(dá)

6、量下降更為顯著。
　　2. SiRNA-1186或tBHP刺激的心肌細(xì)胞中SCAD的表達(dá)量顯著下調(diào)，酶活性顯著下降，游離脂肪酸含量明顯升高，ATP含量明顯降低；與此同時(shí)，siRNA-1186能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞存活率顯著下降，細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞凋亡蛋白caspase3和Bax顯著增加，Bcl-2顯著下降，這與tBHP誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡趨勢一致。
　　3.與siRNA-1186組相比，F(xiàn)eno+siRNA-1186組中SCAD

7、和PPARα的表達(dá)量均顯著上調(diào)，酶活性顯著升高，游離脂肪酸含量明顯下降，ATP含量明顯升高；與 tBHP組相比，F(xiàn)eno+tBHP組中SCAD和PPARα的表達(dá)量亦明顯上調(diào)，酶活性顯著升高，游離脂肪酸含量明顯下降，ATP含量明顯升高；且Feno預(yù)處理后細(xì)胞存活率明顯升高，細(xì)胞凋亡率下降，細(xì)胞凋亡蛋白caspase3和Bax顯著下降，Bcl-2顯著升高。
　　4.與 tBHP組相比，AICAR+tBHP組中SCAD、PPARα和p-