建鯉極長鏈脂酰輔酶A脫氫酶基因克隆、表達及多態(tài)性分析.pdf

1、極長鏈脂酰輔酶A脫氫酶（VLCAD）是脂肪酸β氧化第一步反應的催化酶。建鯉VLCAD基因有兩種型，分別是jlVLCAD-a和jlVLCAD-b，它們共同含有20個外顯子和19個內含子。利用RT-PCR、RACE方法，獲得了jlVLCAD-a型的完整cDNA序列，共2543bp，包括293bp的5'非翻譯區(qū)、1980bp閱讀框以及270bp的3'非翻譯區(qū)，閱讀框共編碼659個氨基酸。通過已知序列設計引物，擴增完整DNA片段，其中jlVLC

2、AD-a，除了內含子8和13外全部獲得，而jlVLCAD-b中外顯子部分缺少5'和3'端部分序列，內含子部分則全部克隆獲得。分析jlVLCAD-a氨基酸序列結構，發(fā)現(xiàn)它含有N端結構域，中間結構域，C端結構域，而功能位點有FAD結合位點，底物結合口袋，催化住點，且都存在與結構域中，高度保守。同源性分析表明，jlVLCAD-a氨基酸序列與其它如斑馬魚、羅非魚、孔雀魚等相似性高達80.0％以上，與其它脊椎哺乳動物相似性也超過70.0％。而在系

3、統(tǒng)進化樹分析中發(fā)現(xiàn)，建鯉VLCAD-a屬于魚類分支，且與斑馬魚親緣關系最近。
　　通過設計jlVLCAD兩種基因型的公共引物，采用實時熒光定量法分析jlVLCAD在各個組織的表達狀況，發(fā)現(xiàn)jlVLCAD基因在肝臟、肌肉、心臟、前腸、腦、腎臟、脾臟、鰓這8個組織中均有表達，其中jlVLCAD在心臟表達量為最高，肌肉和腦次之，肝臟、前腸、腎臟、鰓中表達量相對較少，脾臟中的表達量最低。各個組織中都存在β氧化反應，表達量的差異性，說明組織

4、對脂肪酸氧化供能需求不一樣，其中心臟和肌肉需求量最高。
　　VLC AD是脂肪酸β氧化的限速酶，在催化底物方面有一定的選擇性，本實驗在建鯉日糧中分別添加富含C22:6n-3的魚油和富含C18:3n-3的亞麻油，檢測不同碳鏈長的脂肪酸對肌肉和肝臟jlVLCAD表達量的影響。結果在肌肉和肝臟中，jlVLCAD的表達量差異不顯著(P＞0.05)，說明jlVLCAD的表達水平不受C22和C18的影響。之后，進行一周的饑餓脅迫，發(fā)現(xiàn)肌肉中j

5、lVLCAD的表達量顯著上升(P＜0.05)，同樣進行低溫應激，也發(fā)現(xiàn)肌肉中jlVLCAD的表達量上升明顯(P＜0.01)，這都表明了饑餓脅迫和低溫應激都能促進脂肪酸β氧化。
　　脂肪含量是魚類選育的重要標準，本文利用生物電阻抗法(BIA)，計算出建鯉背部肌肉脂肪成分的相對含量，并以此為基礎性狀進行SNP篩選。VLCAD與脂肪酸代謝密切相關，本實驗在建鯉VLCAD-a中篩選出4個可檢測的SNP位點，除了G1031T是內含子上的SN