油桐長鏈脂酰輔酶A合成酶基因的克隆與功能表達研究.pdf

1、油桐（Vernicia fordii）隸屬大戟科(Euphorbiaceae)油桐屬，是我國四大木本油料樹種之一。油桐的種仁含油量高達60％，個別超過70％，桐油的脂肪酸含量主要包含硬脂酸、軟脂酸、桐酸、亞油酸、亞麻酸以及油酸，其中，桐酸是油桐所特有的脂肪酸，占總脂肪酸含量的80％左右，對桐油的理化性質(zhì)起決定性作用。桐油具有良好的耐熱、耐寒、耐酸堿、絕緣、防腐等性狀，是一種環(huán)保型化工原料，可用于制作涂料、油漆、藥品等。同時，桐油還是制作

2、生物柴油的重要原料。本研究以油桐‘葡萄桐’品種的種子、不同組織部位、器官以及不同種子發(fā)育時期為材料，在本實驗室已經(jīng)構(gòu)建的油桐轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上，對于長鏈脂酰輔酶A合成酶家族基因中的VfLACS4、VfLA CS6和VfLACS7基因進行了全長cDNA的克隆以及相關(guān)表達分析，為進一步研究LACS基因家族以及油桐脂肪酸代謝提供理論依據(jù)，主要研究結(jié)果如下:
　　1、油桐LA CS基因家族中VfLACS6、VfLACS7基因的cDNA克隆

3、以及生物信息學(xué)分析。以油桐‘葡萄桐’品種近成熟種子為材料，在本實驗已構(gòu)建的油桐轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上，采用常規(guī)PCR擴增克隆技術(shù)，獲得油桐長鏈脂酰輔酶A合成酶基因家族中兩個成員基因的cDNA序列，分別將其命名為VfLA CS6(GenBank登錄號:KY012243)和VfLACS7（GenBank登錄號:KY012244）。其中，VfLACS6基因的cDNA序列全長2085bp，ORF為2085bp，編碼694個氨基酸，有4個比較明顯的跨

4、膜區(qū)，所編碼的蛋白質(zhì)分子量為76.11kDa，pI理論值為6.55; VfLACS7基因的cDNA序列全長2088bp，ORF為2088bp，編碼695個氨基酸，有8個比較明顯的跨膜區(qū)，所編碼的蛋白質(zhì)分子量為77.30kDa，pI理論值為6.64。通過氨基酸比對發(fā)現(xiàn)，VfLACS6和VfLA CS7基因均具有AMP綁定鏈接（結(jié)合）域保守序列(ICYTSGTGDPK)，表明這兩個基因?qū)儆贚ACS家族。
　　2、油桐LACS基因家族中

5、VfLACS4、VfLACS6和VfLACS7基因的原核表達。利用pET30a和BL21(DE3)原核表達體系，在已經(jīng)獲得VfLACS4、VfLACS6和VfLACS7基因全長cDNA序列基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了原核表達載體pET30a-VfLACS4、pET30a-VfLACS6和pET30a-VfLACS7，并分別獲得了表觀量約為74kDa、76kDa和77kDa相應(yīng)的目的蛋白。
　　3、油桐LACS基因家族中VfLACS4、VfL

6、ACS6和VfLACS7基因的酵母表達。利用pYES2酵母表達體系，在已經(jīng)獲得的VfLACS4、VfLACS6和VfLACS7基因全長cDNA序列基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了酵母表達載體pYES2-VfLACS4、pYES2-VfLACS6和pYES2-VfLACS7，繪制相應(yīng)生長曲線，獲得VfLACS6和VfLACS7基因的相應(yīng)目的蛋白。
　　4、油桐LACS基因家族中VfLACS6和VfLACS7蛋白之間的互作關(guān)系分析。在已經(jīng)獲得的Vf

7、LACS6和VfLACS7基因全長cDNA序列基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建相應(yīng)誘餌載體pGBKT7-VfLACS7以及文庫載體pGADT7-VfLACS6，轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109中，經(jīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)以及X-gal顯色反應(yīng)實驗驗證，均證實VfLACS6和VfLACS7蛋白之間并無相互作用關(guān)系，從而說明VfLACS6與VfLACS7蛋白各自獨立參與相應(yīng)油桐油脂合成代謝及分解代謝。
　　5、油桐LACS基因家族中VfLACS6和VfLACS7時空表達分

8、析。采用實時熒光定量PCR技術(shù)，分析了油桐不同組織、器官以及種子不同發(fā)育時期中VfLACS6和VfLACS7基因的表達量。VfLACS6基因在根和莖中表達量最高，在花瓣中表達量相對較低，VfLA CS6基因在油桐不同組織、器官的表達量由大到小依次為:根＞莖＞葉＞花萼＞雄蕊＞柱頭＞子房＞花瓣，說明VfLACS6基因在角質(zhì)組成，油脂合成代謝中起到重要作用。VfLACS6在種子發(fā)育的9月20日相對表達量最高，在10月24日相對表達量最低;Vf