油菜長鏈脂酰CoA合成酶基因的克隆與功能鑒定.pdf

1、在油料作物中，種子油脂是對人類最具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生活必需品和工業(yè)原料，提高種子油脂含量也就是提升油料作物的生產(chǎn)效益。本文主要通過克隆長鏈?；o酶A合成酶基因并鑒定其在油脂合成途徑中的生物學(xué)功能，從而期望通過基因工程手段提高油料作物種子含油量。
　　 長鏈?；o酶A合成酶(LACS)把游離脂肪酸活化成為長鏈酰基輔酶A，從而在脂肪酸的合成與分解代謝中起著重要作用。這類重要的酶參與若干種與脂肪酸相關(guān)的代謝，如脂肪酸鏈的活化和延伸，磷脂、

2、甘油三酯、茉莉酸的生物合成等。最近我們實(shí)驗(yàn)室從油菜油脂合成旺盛部位(花和發(fā)育期的種子)分離出四個(gè)長鏈脂酰輔酶A合成酶基因(BnLACS1、BnLACS2、BnLACS3和BnLACS4)。生物信息學(xué)分析顯示這四個(gè)長鏈脂酰輔酶A合成酶(BnLACSs)氨基酸序列都具有三個(gè)Block，初步被認(rèn)為屬于LACS家族。分子進(jìn)化樹分析顯示，BnLACS1與擬南芥AtLACS1具有較高的同源性，BnLACS2和BnLACS3與擬南芥AtLACS2具有

3、較高的同源性，AtLACS1和AtLACS2定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，在植物角質(zhì)主要成分長鏈脂肪酸的合成中起著重要作用。BnLACS4與定位于葉綠體的AtLACS9有較高的同源性。
　　 通過酵母LACS缺陷型補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證明四個(gè)BnLACSs都具有LACS活性。油菜BnLACSs蛋白都偏好利用長鏈脂肪酸。在水解蛋白酶缺陷型酵母pep4中異源表達(dá)，結(jié)果顯示BnLACS1和BnLACS2能夠使宿主酵母的脂肪酸和油脂含量顯著提高。以上在酵

4、母真核表達(dá)系統(tǒng)中的結(jié)果初步確定BnLACS1和BnLACS2參與油脂合成，并且能夠使酵母油脂含量提高。
　　 利用RT-PCR技術(shù)分別分析了BnLACS1、BnLACS2、BnLACS3和BnLACS4在不同含油量油菜品系種子(35DAP)中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示在高含油量品系中這些基因表達(dá)更為強(qiáng)烈。研究這四個(gè)基因在高含油量油菜(50％)和低含油量油菜(30％)兩個(gè)油菜品系的種子發(fā)育時(shí)期的表達(dá)豐度動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果顯示BnLACS1和

5、BnLACS2表達(dá)量變化趨勢與種子發(fā)育期油脂合成速率的S型曲線趨勢一致，并且結(jié)果還進(jìn)一步驗(yàn)證BnLACS1和BnLACS2表達(dá)量在高含油量油菜品系種子明顯高于低含油量油菜品系種子。以上結(jié)果顯示BnLACSs，尤其是BnLACS1和BnLACS2在油菜種子的油脂合成途徑中起著重要作用。
　　 為了鑒定油菜BnLACSs的生物學(xué)功能，我們還構(gòu)建了各個(gè)基因的雙元植物表達(dá)載體，載體中利用在種子中特異表達(dá)的Napin啟動(dòng)子，然后通過農(nóng)桿菌