肺炎鏈球菌HMG-CoA合成酶和還原酶基因克隆表達(dá)及功能研究.pdf

1、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）是引起腦膜炎、菌血癥、肺炎等疾病的主要致病菌，近年來由于環(huán)境污染和抗生素的亂用而造成多藥抗性的肺炎鏈球菌菌株逐年增加，抗性逐年增強(qiáng)。深入研究肺炎鏈球菌等革蘭氏陽性球菌致病機(jī)理和代謝過程十分重要，將為新的抗生素研發(fā)提供新的作用位點(diǎn)或靶標(biāo)?，F(xiàn)代微生物學(xué)研究表明甲羥戊酸的代謝過程是肺炎鏈球菌等革蘭氏陽性球菌生長所必需的，甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway）是一種潛在

2、的藥物作用靶標(biāo)。我們選擇HMG-CoA合成酶和HMG-CoA還原酶作為靶酶，研究其抑制劑影響肺炎鏈球菌正常生理代謝的作用機(jī)理，從而阻止病原菌賴以生存的甲羥戊酸代謝途徑。 本研究以肺炎鏈球菌為材料，采用基因工程技術(shù)克隆表達(dá)了肺炎鏈球菌HMG-CoA合成酶（HMGS）和HMG-CoA還原酶（HMGR）基因，進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)特性和功能研究。同時(shí)，構(gòu)建了肺炎鏈球菌HMG-CoA合成酶和HMG-CoA還原酶三維空間結(jié)構(gòu)模型，利用篩選抑制劑生物

3、活性檢測方法對(duì)用分子對(duì)接技術(shù)和網(wǎng)格計(jì)算技術(shù)在化合物數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行高通量虛擬篩選出的抗生素先導(dǎo)化合物進(jìn)行了實(shí)際篩選。本文主要得到以下研究結(jié)果： 1.從肺炎鏈球菌基因組DNA中克隆了HMGS基因，基因序列分析表明：該基因與文獻(xiàn)中報(bào)道的肺炎鏈球菌HMGS基因（No.AF290098）相比較有98.5％的同源性，存在18個(gè)核苷酸的差異，其中有2個(gè)核苷酸的不同導(dǎo)致編碼的氨基酸改變，分別是Asn259→Ser，Ala349→Val。將HMGS

4、基因亞克隆到pET-28未能正常表達(dá)，分析發(fā)現(xiàn)在第226核苷酸處A突變成T，導(dǎo)致形成了終止密碼子。通過對(duì)T226進(jìn)行反突變，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-HMGSm并成功表達(dá)。該基因編碼蛋白由398個(gè)氨基酸組成。 2.通過優(yōu)化重組HMGS的表達(dá)條件，在18℃0.4mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h，利用Ni-NTA層析柱分離純化得到了46kDa特異性蛋白（重組HMGS）。重組肺炎鏈球菌HMGS酶學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)：該酶最適pH9.75，最適MgC

5、l2濃度為10mM/mL，最適溫度37℃。粗酶提取物的比活為0.76μmol/min/mg，分離純化后比活為3.24μmol/min/mg，比活提高4.26倍。動(dòng)力學(xué)分析表明：該酶Vmax和Km分別為4.69μmol/min/mg和Km為213μM。 3.從肺炎鏈球菌基因組DNA中克隆了HMGR基因，該基因與文獻(xiàn)中報(bào)道的肺炎鏈球菌HMGR基因（No.AF290098）相比較有99.9％的同源性，存在7個(gè)核苷酸的差異，其中有3個(gè)核

6、苷酸的不同引起編碼氨基酸的改變，分別是Glu44→Val，Asn46→Asp，Gly72→Glu。該基因編碼蛋白由424個(gè)氨基酸組成。構(gòu)建了克隆重組表達(dá)載體pET-HMGR，在30℃經(jīng)1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，Ni-NTA層析柱分離純化后獲得了47kDa的特異性蛋白。動(dòng)力學(xué)分析表明肺炎鏈球菌HMGR的最適pH6.5，最適溫度37℃。粗酶提取物的比活為11.22μmol/min/mg，分離純化后比活為31.98μmol/min/mg，比活

7、提高2.8倍。在37℃，pH6.5時(shí)的Vmax和Km分別為62.1μmol/min/mg和260μM。用表達(dá)純化后的HMGR蛋白免疫新西蘭大白兔，提取抗血清，ELISA檢測其效價(jià)為1：320，000，Western雜交進(jìn)一步證明HMGR具有較高的免疫學(xué)活性。 4.以糞腸球菌HMGS和假單胞菌HMGR晶體結(jié)構(gòu)為模板，通過SYBYL7.0軟件，成功地構(gòu)建了鏈球菌HMGS和HMGR的同源模建。采用計(jì)算機(jī)分析三維結(jié)構(gòu)，用同源模建的方法尋

8、找結(jié)構(gòu)類似物來研究新藥的開發(fā)是一個(gè)新的領(lǐng)域。本研究分析了肺炎鏈球菌HMGS和HMGR的三維結(jié)構(gòu)，根據(jù)其同源模建和三維結(jié)構(gòu)，利用分子對(duì)接技術(shù)和網(wǎng)格計(jì)算技術(shù)在化合物數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行高通量虛擬篩選競爭性抑制劑。 5.建立了采用重組肺炎鏈球菌HMGR篩選抑制劑苗頭化合物的生物活性檢測方法。對(duì)利用分子對(duì)接技術(shù)和網(wǎng)格計(jì)算技術(shù)在化合物數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行高通量虛擬篩選出的30種苗頭化合物進(jìn)行了實(shí)際篩選。初步分析結(jié)果表明：在候選的30種苗頭化合物中，篩選到

9、一種比傳統(tǒng)的競爭性抑制劑洛伐它汀具有更佳抑制效果的10號(hào)抑制劑，其抑制常數(shù)Ki為76μM，而洛伐它汀的抑制常數(shù)Ki為353μM。篩選到的該化合物通過進(jìn)一步的藥理、毒理、臨床研究，有望研發(fā)成為治療革蘭氏陽性球菌的新藥物。 6.洛伐它汀是HMGR的競爭性抑制劑，對(duì)肺炎鏈球菌HMGR具有一定的抑制效果，而洛伐它汀對(duì)HMGS幾乎沒有抑制作用。重組HMGR篩選苗頭化合物使用的底物HMG-CoA費(fèi)用昂貴，極大地限制了實(shí)際篩選，通過克隆表達(dá)的