番茄葉綠體谷胱甘肽還原酶基因的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、逆境脅迫是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上面臨的嚴(yán)峻問(wèn)題之一，逆境會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧?；钚匝蹩梢鸬鞍踪|(zhì)、膜脂和其他細(xì)胞組分的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞及組織死亡。谷胱甘肽還原酶作為植物活性氧清除系統(tǒng)中的一個(gè)關(guān)鍵酶，對(duì)于保護(hù)植物免受活性氧的破壞具有十分重要的作用。本研究從番茄葉片中分離到葉綠體谷胱甘肽還原酶基因，并對(duì)該基因的表達(dá)和功能進(jìn)行了分析。主要結(jié)果如下： 1.利用同源序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)RT-PCR的方法從番茄葉片克隆到谷胱甘肽還原酶

2、基因的中間片段，通過(guò)5’-RACE和3’-RACE分別克隆到5’和3’片段，拼接后設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增到全長(zhǎng)cDNA，命名為L(zhǎng)eGR(EU285581)。該基因全長(zhǎng)為1772 bp，ORF為765 bp，編碼255個(gè)氨基酸，分子量約為33 kDa。同源序列比較表明，番茄谷胱甘肽還原酶基因的序列與煙草、擬南芥、水稻、豌豆、蕓苔的谷胱甘肽還原酶基因的序列同源性較高。 2.Northern雜交分析顯示，LeGR在不同器官中呈非特異性表達(dá)，

3、在葉片、莖、花萼等葉綠素含量高的組織中表達(dá)量較高。 3.LeGR受低溫和高溫誘導(dǎo)，其表達(dá)量明顯高于常溫下，且其表達(dá)水平隨逆境處理時(shí)間的延長(zhǎng)而變化。4℃處理下6 h表達(dá)量最高，40℃處理下12 h表達(dá)量最高。 4.將獲得的LeGR與含有35S啟動(dòng)子的pBI121載體重組，分別構(gòu)建了正義和反義表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄。 5.構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-LeGR，并在大腸桿菌BL21中表達(dá)融合蛋白，SDS