非生物脅迫下番茄葉綠體單脫氫抗壞血酸還原酶基因的表達和功能分析.pdf

1、逆境脅迫是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的嚴(yán)峻問題之一，影響作物生長發(fā)育，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)降低。植物即使生長在適宜條件下，在進行呼吸和光合電子傳遞時也會產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。鹽漬、干旱、極端溫度、臭氧等非生物脅迫均可以導(dǎo)致ROS大量產(chǎn)生，若未及時清除，ROS便會攻擊蛋白質(zhì)、核酸、脂類等生物大分子引起氧化損傷，進而導(dǎo)致細胞及組織死亡。植物葉綠體是ROS產(chǎn)生的主要部位之一，環(huán)境脅迫下葉綠體內(nèi)產(chǎn)生的ROS的快速

2、清除有助于保護光合機構(gòu)，維持植物光合功能?？箟难幔╝scorbate，AsA）是葉綠體活性氧清除系統(tǒng)的關(guān)鍵組分，在脅迫條件下葉綠體AsA因迅速氧化而損失。葉綠體單脫氫抗壞血酸還原酶（chloroplasticmonodehyedroascorbate reductase，chlMDAR）是葉綠體AsA再生的關(guān)鍵酶，它還原單脫氫抗壞血酸再生出AsA，從而維持葉綠體AsA水平。因此，研究MDAR基因與植物抗逆性的關(guān)系具有重要意義。

3、　　 本研究從番茄葉片克隆了番茄葉綠體單脫氫抗壞血酸還原酶基因（LeMDAR），并對該基因的表達和功能進行了分析。
　　 1.利用同源序列設(shè)計兼并引物，通過RT-PCR的方法從番茄葉片克隆到葉綠體MDAR基因的中間片段，通過5’-RACE和3’-RACE分別克隆到5’片段和3’片段，拼接后設(shè)計特異引物擴增到全長cDNA。命名為LeMDAR（DQ665255）。該基因全長為1940bp，ORF為1449 bp，編碼483個氨基酸

4、，分子量約為53 kDa。同源序列比較發(fā)現(xiàn)，番茄葉綠體單脫氫抗壞血酸還原酶基因的序列與菠菜、擬南芥、甘藍、芥菜、馬蹄蓮、海欖雌和胡黃連的MDAR基因的序列同源性較高。結(jié)構(gòu)同源性分析表明LeMDAR有三個序列保守的結(jié)構(gòu)域，domainⅠ和domainⅡ是FAD或NAD（P）H的ADP結(jié)合區(qū)域，domainⅢ是FAD的黃素的結(jié)合區(qū)域。
　　 2.將p35S-LeMDAR-GFP融合蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中瞬時表達。通過Confocal

5、觀察到GFP激發(fā)的綠色熒光和葉綠素的紅色自發(fā)熒光完全重合，說明LeMDAR基因產(chǎn)物定位于葉綠體。
　　 3.Northern雜交分析表明，LeMDAR基因在葉綠素含量高的組織中表達量較高。同時該基因的表達受低溫、高溫、鹽、干旱等脅迫誘導(dǎo)，其表達水平隨脅迫處理時間的延長而變化。
　　 4.將獲得的LeMDAR基因與含有35S啟動子的pBI121載體重組，分別構(gòu)建了正義和反義表達載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄，用PCR

6、及Northern雜交的方法對帶卡那抗性的轉(zhuǎn)基因番茄植株進一步檢測，結(jié)果證明成功地獲得了轉(zhuǎn)正義和反義基因的番茄植株。與野生型植株相比，過表達LeMDAR基因的番茄葉片MDAR活性和AsA含量增加，脫氫抗壞血酸（dehydroascorbate，DHA）含量下降，AsA還原狀態(tài)高于野生型。LeMDAR基因表達發(fā)生沉默的番茄植株中MDAR活性和AsA含量降低，DHA含量增加，AsA的還原狀態(tài)顯著低于野生型。
　　 5.構(gòu)建了原核表達

7、載體pET-LeMDAR，并在大腸桿菌BL21中表達融合蛋白，將誘導(dǎo)帶切下，溶于PBS獲得抗原，免疫小白鼠，其抗血清效價為1:500。Western雜交表明，轉(zhuǎn)正義基因植株中LeMDAR基因已在蛋白水平過量表達，但是轉(zhuǎn)反義基因植株LeMDAR基因的表達明顯受到抑制。
　　 6.正常生長條件下，野生型與轉(zhuǎn)正義、反義基因植株生長量無明顯差別。但是，溫度和NaCl脅迫條件下，轉(zhuǎn)正義基因番茄幼苗生長量明顯高于野生型，而轉(zhuǎn)反義基因植株生長

8、明顯受到抑制，過表達LeMDAR基因提高了番茄植株的抗逆能力。
　　 7.在低溫弱光（4℃，100μmol m-2s-1）和高溫（40℃）脅迫條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因株系的凈光合速率（Pn）和PSII最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）下降，但與野生型相比，轉(zhuǎn)正義基因株系S17和S4的下降緩慢，而轉(zhuǎn)反義基因株系A(chǔ)14和A1的下降更為明顯。這表明LeMDAR的過表達減輕了PSII的光抑制程度，與野生型相比，轉(zhuǎn)正義基因植株P(guān)SII反應(yīng)中心受傷

9、害較輕，而轉(zhuǎn)反義基因番茄的PSII反應(yīng)中心受傷害較重。在低溫弱光處理過程中轉(zhuǎn)基因植株與野生型的氧化態(tài)P700降低，恢復(fù)48 h后，轉(zhuǎn)正義基因植株S17和S4分別恢復(fù)到原來的96.0％和93.3％，而野生型和轉(zhuǎn)反義基因植株A14和A1分別恢復(fù)到原來的82.8％，73.5％和71.6％。經(jīng)過24 h處理，轉(zhuǎn)基因和野生型的H2O2和丙二醛含量均增加，轉(zhuǎn)反義基因植株顯著高于野生型，但是轉(zhuǎn)正義基因植株增加不明顯。
　　 8.分別用50μM

10、和100μM甲基紫精（Methyl viologen，MV）處理野生型與轉(zhuǎn)基因番茄葉圓片24 h，與野生型相比，轉(zhuǎn)正義基因番茄葉圓片有少的失綠；轉(zhuǎn)反義基因植株失綠非常嚴(yán)重，幾乎看不到綠色。與之相對應(yīng)，轉(zhuǎn)正義基因植株葉圓片有較高的葉綠素含量，其次是野生型葉圓片，而轉(zhuǎn)反義基因植株葉圓片的葉綠素含量極低。這表明過表達TeMDAR提高了番茄抗甲基紫精誘導(dǎo)的氧化脅迫的能力。
　　 用100μM MV處理后，轉(zhuǎn)基因和野生型番茄葉片的凈光合速

11、率（Pn）均下降，但轉(zhuǎn)反義基因植株P(guān)n下降更明顯，處理24 h后S17、S4、WT、A14和A1的Pn分別下降了27.5％、34.3％、52.1％、64.0％和70.6％。同時，PSII最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）也下降，但是下降不如光合速率明顯。MV處理24 h后，野生型和轉(zhuǎn)基因番茄H2O2顯著增加，轉(zhuǎn)反義基因植株中H2O2增加到未處理時的3倍。MV處理過程中，與野生型相比，轉(zhuǎn)正義基因植株抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性相對穩(wěn)定，降低

12、較少，但是轉(zhuǎn)反義基因植株APX活性顯著降低。這些結(jié)果表明，過表達LeMDAR提高了番茄AsA含量，維持了APX的活性，保護光合機構(gòu)，使轉(zhuǎn)正義基因番茄具有更強的抗氧化脅迫能力。
　　 9.200 mM NaCl和20％（w/v）PEG-6000處理下，與野生型相比，轉(zhuǎn)正義轉(zhuǎn)基因表現(xiàn)出高的Pn和低的H2O2水平。滲透脅迫下，轉(zhuǎn)正義基因植株Fv/Fm降低的程度顯著低于野生型。而反義轉(zhuǎn)基因株系對NaCl和PEG處理最為敏感。