煙曲霉金屬還原酶基因敲除及初步功能分析.pdf

1、目的:煙曲霉（Aspergillus fumigatus）是一種重要的條件致病真菌，而對(duì)其致病機(jī)制還不清楚。本課題采用基因敲除的方法將煙曲霉的金屬還原酶基因進(jìn)行敲除，并對(duì)該基因的功能進(jìn)行初步研究，進(jìn)而為揭示該基因與煙曲霉致病性的關(guān)系提供基礎(chǔ)。
　　 方法:利用巢式-重疊PCR的方法獲得敲除該金屬還原酶基因所需的融合片段，同時(shí)確定制備轉(zhuǎn)化所需的原生質(zhì)體的條件。再利用Split-Marker技術(shù)和CaCl2-PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體法將

2、獲得融合片段轉(zhuǎn)移到煙曲霉Af293菌株中，獲得轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子先用潮霉素抗性初篩，再通過(guò)PCR以及測(cè)序進(jìn)行鑒定。將獲得缺失株和野生菌株Af293分別接種到AMM、無(wú)鐵AMM、AMM+EDTA以及無(wú)鐵AMM+EDTA固體和液體培養(yǎng)基中，分別觀察菌落生成情況以及菌絲的生長(zhǎng)狀態(tài)的變化。同時(shí)還利用DNAstar軟件對(duì)金屬還原酶的氨基酸序列進(jìn)行種內(nèi)和種間的序列分析，探索該金屬還原酶的功能。
　　 結(jié)果:成功利用巢式-重疊PCR構(gòu)建了金屬還原

3、酶基因所需的融合片段，并初步證實(shí)巢式PCR的使用可以在一定程度上增加產(chǎn)物特異性。同時(shí)，確定選用菌齡為12h的菌絲，用山梨醇為滲透壓穩(wěn)定劑制備出轉(zhuǎn)化所需的原生質(zhì)體。經(jīng)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化以及潮霉素抗性的篩選，獲得了14株轉(zhuǎn)化子。再經(jīng)過(guò)PCR篩選和測(cè)序鑒定，最終獲得兩株金屬還原酶基因的缺失菌株。對(duì)該缺失菌株的表型研究中發(fā)現(xiàn)，在上述四種固體培養(yǎng)基中，其菌落大小與野生型的無(wú)明顯區(qū)別。而在液體培養(yǎng)基中其菌絲長(zhǎng)度也與野生型無(wú)區(qū)別。而在對(duì)該金屬還原酶的序列分

4、析中發(fā)現(xiàn)，其具有鐵氧還蛋白還原酶(Ferredoxin reductase，F(xiàn)NR)超家族含有NOX_Duox_like_FAD_NADP結(jié)構(gòu)域。并發(fā)現(xiàn)在煙曲霉中，該金屬還原酶與另外一基因(AFUA8G06210)編碼的金屬還原酶有很高的同源性。
　　 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法以及Split-Marker重組技術(shù)成功構(gòu)建了該金屬還原酶基因的缺失菌株。序列分析證實(shí)該金屬還原酶為FNR超家族的成員。而獲得缺失菌株為揭示該基