中華蜜蜂鐵代謝相關(guān)蛋白及蛋氨酸甲基亞砜還原酶B基因的生物學(xué)功能分析.pdf

1、近年來，自然環(huán)境破壞嚴重，蜜蜂的飼養(yǎng)環(huán)境持續(xù)惡化，蜂群崩潰失調(diào)現(xiàn)象(Colonycollapse disorder, CCD)頻發(fā)。美國、歐洲部分地區(qū)的西方蜜蜂(Apis mellifera Linnaeus)損失量超過30％，因此造成的直接蜂群損失和繼發(fā)的作物損失不可估量。CCD的原因尚未明確，各種疾病的肆虐和農(nóng)藥的大量使用均成為了學(xué)者們的猜測對象。西方蜜蜂和東方蜜蜂(Apis cerana Fabricius)均屬于蜜蜂屬，親緣關(guān)系

2、較近，意大利蜜蜂（A.m.ligustica，簡稱意蜂）和中華蜜蜂(Apis cerana cerana，簡稱中蜂)分別是其中的代表。意蜂在我國的飼養(yǎng)量遠超中蜂，在部分地區(qū)甚至出現(xiàn)混養(yǎng)現(xiàn)象，可是意蜂出現(xiàn)的CCD現(xiàn)象并未在中蜂群中出現(xiàn)，其中緣由尚未可知，因此探究中蜂自身的免疫機理勢在必行。
　　蛋氨酸甲基亞砜還原酶B具有清除機體自由基、保護機體免受氧化損傷、抵御外源毒物的作用;鐵代謝相關(guān)蛋白則通過調(diào)節(jié)體內(nèi)游離鐵水平避免產(chǎn)生自由基，清

3、除體內(nèi)已有活性氧、防止病原微生物侵染作用。本研究以中華蜜蜂(A.c.cerana)為實驗材料，開展了蛋氨酸甲基亞砜還原酶B(methionine sulfoxide reductase B，MsrB)和鐵代謝相關(guān)蛋白（轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin）、鐵蛋白（Ferritin））基因的功能研究，從分子水平上探討中蜂自身免疫力與中華蜜蜂蛋氨酸甲基亞砜還原酶B及鐵代謝相關(guān)蛋白基因的聯(lián)系。具體研究結(jié)果與主要結(jié)論如下:
　　(1)中蜂A

4、ccMsrB基因的分子特性和功能分析
　　根據(jù)意蜂(A.melliferaligustica)的同源序列，利用RT-PCR和RACE-PCR的方法，首次克隆了中蜂MsrB基因，命名為AccMsrB（GenBank注冊號:KP317814）。序列分析表明，其cDNA全長為757bp，包括138 bp的5'非翻譯區(qū)(UTR)、205bp的3'非翻譯區(qū)(UTR)和414bp的開放閱讀框(ORF)，編碼一段137個氨基酸的多肽，分子量和等

5、電點分別為15.5 kDa和7.77。氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)AccMsrB的氨基酸序列與其他昆蟲，特別是蜜蜂科昆蟲MsrBs有較高的同源性，并具有MsrBs中保守的功能區(qū)域。用TFSEARCH軟件分析AccMsrB啟動子，預(yù)測到兩個與調(diào)節(jié)環(huán)境應(yīng)激有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(HSF和Dfd)。表明，AccMsrB基因可能參與發(fā)育和環(huán)境應(yīng)激響應(yīng)。
　　采用qRT-PCR和免疫組織化學(xué)的方法研究了AccMsrB在不同發(fā)育時期和組織中的時空表達特性，

6、結(jié)果表明，AccMsrB在整個變態(tài)發(fā)育過程中均表達，其中在變態(tài)發(fā)育節(jié)點:1齡幼蟲(L1)、預(yù)蛹期(prepupa，PP)及15日齡成蜂(A15)時期表達量最高;在各組織中表達量呈現(xiàn)差異，其中表皮中表達量最高，肌肉中次之;免疫組織化學(xué)結(jié)果也顯示AccMsrB在體壁和眼部組織存在。表明AccMsrB可能與幼蟲發(fā)育階段轉(zhuǎn)換、抵御外界氧化損傷及清除體內(nèi)自由基等功能相關(guān)。
　　應(yīng)用qRT-PCR方法探究了AccMsrB在成蜂中不同應(yīng)激處理下

7、的表達特性。結(jié)果表明，AccMsrB基因受非適宜溫度、UV、H2O2、農(nóng)藥、重金屬等因素應(yīng)激的誘導(dǎo)表達。各因素處理后蜜蜂體內(nèi)H2O2濃度保持在高濃度，驗證了這種誘導(dǎo)是氧化應(yīng)激的結(jié)果，表明AccMsrB可能在氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。
　　(2)中華蜜蜂鐵代謝相關(guān)蛋白基因的分子特性和功能分析利用上述方法，首次克隆了中華蜜蜂鐵代謝相關(guān)基因，分別命名為:AccTf(GenBank注冊號:JF330111.1)、AccFTH及AccFTL（

8、GenBank注冊號:JF330112.1和JF340051.1）。該組基因cDNA全長分別2346、1028及1018 bp，其中5'非翻譯區(qū)分別為74bp、219 bp和274bp，3'UTR分別為133 bp、134bp和90 bp，ORF分別為:2139 bp、675bp和654bp，分別編碼包含712、219和218個氨基酸殘基的多肽，分子量分別為78.6、25.5及25.2 kDa，等電點分別為7.07、6.25及6.52。

9、氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)AccTf、 AccFTH及AccFTL的氨基酸序列與其他昆蟲相關(guān)序列同源性較高。
　　對鐵代謝相關(guān)基因進行基因序列分析，發(fā)現(xiàn)在AccFTH的5'UTR存在該基因家族的保守序列——鐵反應(yīng)元件(IRE)，該元件可以形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，是鐵調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點，在調(diào)控鐵吸收與釋放代謝過程起重要作用;通過分析啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域含有部分與免疫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（HSF、AP-1、Nrf2、NFκB等）;分析氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，在

10、轉(zhuǎn)鐵蛋白N-端含有該基因家族的保守氨基酸構(gòu)成的鐵結(jié)合位點;鐵蛋白重鏈中含有構(gòu)成鐵氧化中心的保守氨基酸及保守的半胱氨酸;輕鏈序列中存在保守的糖基化位點(N-E-F)及保守的半胱氨酸。表明AccTf、AccFTH及AccFTL是典型的轉(zhuǎn)鐵蛋白及鐵蛋白，可能參與蜜蜂的鐵代謝和應(yīng)激保護機制。
　　利用qRT-PCR方法研究了AccTf、 AccFTH基因在不同發(fā)育時期和組織中的時空表達特性。結(jié)果表明，該基因分別在L4及PP高水平表達，表明

11、轉(zhuǎn)鐵蛋白及鐵蛋白可能參與蜜蜂發(fā)育時期的轉(zhuǎn)換。在不同組織間，AccTf主要在蜜蜂脂肪體內(nèi)生成，鐵蛋白則在各個組織中均有表達，其中中腸組織為主，均與其他物種中該組基因的表達模式相近。
　　應(yīng)用qRT-PCR的方法研究了AccTf和AccFTH基因在不同條件下的表達特性。表明，AccTf在受到非適宜溫度、各種氧化應(yīng)激和農(nóng)藥處理后均出現(xiàn)誘導(dǎo)上調(diào)，AccFTH基因則只是在部分條件下出現(xiàn)表達上調(diào)，在4℃、42℃及農(nóng)藥處理時出現(xiàn)了抑制現(xiàn)象。表明

12、，中華蜜蜂轉(zhuǎn)鐵蛋白和鐵蛋白可能在中華蜜蜂應(yīng)對大多數(shù)不利因素的應(yīng)激保護中發(fā)揮重要作用。用FeCl3處理后，隨著蜜蜂體內(nèi)鐵離子濃度上升，轉(zhuǎn)鐵蛋白AccTf和AccFTH基因都出現(xiàn)了表達上調(diào)，說明它們受到體內(nèi)游離鐵的誘導(dǎo)，能夠起到儲存和轉(zhuǎn)運鐵離子的作用，以此抑制體內(nèi)氧自由基的形成，起到保護機體免受氧化損傷的作用。
　　以上結(jié)果說明，AccMsrB、AccTf、 AccFTH及AccFTL基因分別具備各自基因家族的典型特征，均具有清除體內(nèi)