蛋氨酸亞砜還原酶A在原代培養(yǎng)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎性激活中的作用及其機(jī)制.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進(jìn)行論述:
　　第一部 分蛋氨酸亞砜還原酶A在小膠質(zhì)細(xì)胞炎性激活中的作用
　　目的：蛋氨酸亞砜還原酶A（Methionine sulfoxide reductase A，MsrA）是蛋氨酸亞砜還原酶家族的重要成員之一，近年來由于其在體內(nèi)氧化還原過程中的作用受到了廣泛關(guān)注。MsrA表達(dá)于高等動物的多數(shù)組織中，在心臟、肝臟等組織中表達(dá)尤為豐富。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，MsrA在包括海馬、皮層、中腦等在內(nèi)的多個腦區(qū)

2、中均有分布。MsrA可以修復(fù)發(fā)生氧化損傷的蛋白，減緩氧化應(yīng)激，對包括神經(jīng)元在內(nèi)的多種細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用。迄今為止，關(guān)于MsrA在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)及其功能鮮有文獻(xiàn)報道。鑒于氧化應(yīng)激在小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活及神經(jīng)炎癥中的重要作用，本部分實驗旨在研究小膠質(zhì)細(xì)胞中是否存在MsrA表達(dá)，以及MsrA是否對脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)具有調(diào)控作用。
　　方法：通過RT-PCR技

3、術(shù)在mRNA水平確定原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中是否存在MsrA mRNA表達(dá)；通過Western blotting方法在蛋白質(zhì)水平確定原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中是否存在MsrA蛋白表達(dá)；通過對原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和大鼠腦片進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，在形態(tài)學(xué)水平確定小膠質(zhì)細(xì)胞中是否存在MsrA的表達(dá)以及MsrA的分布情況；利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)研究MsrA沉默對于LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響；通過轉(zhuǎn)導(dǎo)基因重組Tat-大鼠源性

4、MsrA融合蛋白（Tat-rMsrA fusion protein，Tat-rMsrA）外源性補(bǔ)充小膠質(zhì)細(xì)胞中的MsrA，研究MsrA上調(diào)對于LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響；利用大鼠急性神經(jīng)炎癥模型，在動物水平研究Tat-rMsrA轉(zhuǎn)導(dǎo)對于小膠質(zhì)細(xì)胞激活以及神經(jīng)炎癥的影響。
　　結(jié)果：（1）從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平分別證實原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中存在MsrA的表達(dá)，免疫熒光證實MsrA在小膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿和胞

5、核中均有分布；（2）LPS可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞中的MsrA表達(dá)上調(diào)；（3）慢病毒沉默小膠質(zhì)細(xì)胞中的MsrA可加劇LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；（4）向小膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA可抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；（5）在大鼠急性神經(jīng)炎癥模型中，向海馬齒狀回區(qū)域注射Tat-rMsrA可抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活以及致炎因子的產(chǎn)生。
　　結(jié)論：小膠質(zhì)細(xì)胞中存在MsrA的功能性表

6、達(dá)，且MsrA可負(fù)性調(diào)控LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
　　第二部分 蛋氨酸亞砜還原酶A負(fù)性調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞炎性激活的機(jī)制
　　目的：小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和活性氧（reactive oxygen species，ROS）密切相關(guān)。ROS可以作為“信號分子”激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）以及核因子-κB（nuclear-factor k

7、appa B，NF-κB）等在小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的信號級聯(lián)反應(yīng)，從而加劇小膠質(zhì)細(xì)胞的異?；罨约把装Y反應(yīng)。因此，內(nèi)源性的抗氧化系統(tǒng)可能是炎癥反應(yīng)加劇時重要的“剎車”機(jī)制。已有研究報道蛋氨酸氧化-還原循環(huán)在清除ROS以及保護(hù)蛋白質(zhì)的關(guān)鍵位點免受ROS攻擊的過程中扮演重要角色，而MsrA是調(diào)控蛋氨酸抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，因此，本部分實驗旨在研究小膠質(zhì)細(xì)胞中的MsrA能否通過催化ROS和蛋氨酸（methionine

8、，Met）反應(yīng)清除LPS誘導(dǎo)的ROS生成，并進(jìn)而抑制MAPKs以及NF-κB等信號通路，從而減緩LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
　　方法：通過western blotting方法檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA對于LPS誘導(dǎo)的p38、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、c-jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal ki

9、nase，JNK）以及核因子-κB抑制因子α（inhibitor of kappa Bα，IκBα）磷酸化的影響；通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)研究轉(zhuǎn)導(dǎo)基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA對于LPS誘導(dǎo)的NF-κB的p65亞基入核的影響；通過胞內(nèi)自由基檢測以及胞外超氧化物測定等方法研究轉(zhuǎn)導(dǎo)基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA對于LPS誘導(dǎo)的ROS生成的影響；并通過電子自旋共振（electron spin resonance，ESR）、魯米諾化學(xué)發(fā)

10、光檢測以及蛋氨酸亞砜檢測等技術(shù)研究Tat-rMsrA清除ROS的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：（1）向小膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA可抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中p38、ERK等MAPKs信號通路的激活；（2）向小膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA可抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB信號通路的激活；（3）向小膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)基因重組透膜性蛋白Tat-rMsrA可減緩小膠質(zhì)細(xì)胞激活所引起的氧化應(yīng)激；（