酸敏感離子通道在培養(yǎng)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制.pdf

1、第一部分:酸敏感離子通道在培養(yǎng)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)及功能
　　目的:酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)是一種配體門(mén)控型離子通道,屬于退化蛋白/上皮鈉通道超家族(DEG/ENaC)成員。自1980年在神經(jīng)元細(xì)胞膜上首次被發(fā)現(xiàn)報(bào)道后,受到越來(lái)越多的關(guān)注。神經(jīng)系統(tǒng)中,ASICs廣泛分布于前腦、中腦、腦干、腦橋、小腦、上丘腦、脊髓等部位,隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元外也有大量的ASICs表

2、達(dá),包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞。不同的ASIC亞單位在多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,包括缺血性腦損傷、疼痛、學(xué)習(xí)記憶、癲癇、多發(fā)性硬化、偏頭痛、腸應(yīng)激綜合癥等。已有研究表明,ASICs與免疫炎癥具有密切的關(guān)系,但小膠質(zhì)細(xì)胞上是否有ASICs的表達(dá)目前尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在從基因水平和蛋白水平檢測(cè)ASICs的表達(dá),并研究該通道在小膠質(zhì)細(xì)胞上的特性。
　　方法:采用RT-PCR的方法在mRNA水平檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞ASICs的表達(dá);實(shí)時(shí)

3、定量PCR定量分析ASIC1、2a、3三種亞型在小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的比例;westernblotting方法在蛋白水平檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞ASICs的表達(dá);細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記的方法確定ASICs三種亞型在小膠質(zhì)細(xì)胞上的分布;全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞ASICs電流特性;鈣離子成像的方法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞上ASICs通道的離子通透性。
　　結(jié)果:(1)從基因和蛋白水平分別證實(shí)ASIC1、2a、3三種亞型在小膠質(zhì)細(xì)胞上均有表達(dá),實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明

4、,ASIC1表達(dá)量最多,ASIC3次之,ASIC2a最少。其中,ASIC1和ASIC3在胞漿和胞核中均有分布,而ASIC2a主要分布在胞核。(2)LPS刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞胞外pH值快速降低可誘發(fā)ASIC樣電流,該電流具有pH依賴性,pHB0.5B為6.00±0.04;此外,該電流可被100μM阿米洛利抑制,抑制率為63.15％±6.9%;(3)胞外酸化可引起LPS刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)鈣升高,該作用可被100μM阿米洛利和10nMPcTx1

5、抑制,抑制率分別達(dá)到了61.7%±4.8%和47.3%±6.2%。
　　結(jié)論:小膠質(zhì)細(xì)胞上存在ASICs的表達(dá),其中ASIC1擁有最為豐富的轉(zhuǎn)錄基因。LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞,易化胞外快速酸化誘發(fā)的內(nèi)向電流和胞內(nèi)鈣升高。
　　第二部分:酸敏感離子通道在培養(yǎng)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制
　　目的:炎癥發(fā)生時(shí)常常伴有組織的酸化,即病變處pH值低于正常,這種低pH環(huán)境被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的標(biāo)志,感受這種變化就能在炎癥反應(yīng)中發(fā)

6、揮作用。而機(jī)體中確有一種酸敏感離子通道,能夠感受細(xì)胞外pH的下降,即被細(xì)胞外H+激活,通過(guò)對(duì)Na+和Ca2+的通透形成內(nèi)向電流,導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化,產(chǎn)生興奮性效應(yīng)。目前已經(jīng)證實(shí)ASICs確實(shí)在炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。至于ASICs在小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥的免疫調(diào)節(jié)中的作用還不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在研究ASICs在LPS刺激下對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)和劃痕遷移中的作用。
　　方法:采用western blotting方法觀察LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)

7、細(xì)胞iNOS和COX-2的表達(dá),利用ASICs通道非特異性阻斷劑amiloride和ASIC1a特異性阻斷劑PcTx1研究ASICs在其中發(fā)揮的作用;細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記的方法觀察劃痕誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移,利用ASICs通道非特異性阻斷劑amiloride和ASIC1a特異性阻斷劑PcTx1研究ASICs在其中發(fā)揮的作用。
　　結(jié)果:(1)LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞ASIC1和ASIC2a蛋白表達(dá)增加,且ASIC1膜蛋白表達(dá)增加。(2)L