酸敏感離子通道在AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中過表達(dá)的研究.pdf

1、目的:通過構(gòu)建真核表達(dá)pcDNA3.1/ASIC1a質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)染進(jìn)入AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,建立酸敏感通道在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中過表達(dá)的模型,觀察ASIC1amRNA及其蛋白的相對表達(dá)量變化,檢測酸敏感通道電生理變化以及軟骨細(xì)胞分泌的Ⅱ型膠原量的變化,研究酸敏感通道對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝的影響。
　　方法:將SD大鼠分為正常組、AA模型組,模型組大鼠左側(cè)足趾皮弗氏完全佐劑致炎,檢測大鼠繼發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)腫脹度變化,光學(xué)顯微鏡觀察關(guān)節(jié)病理變化。AA

2、大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)及Alcian對軟骨細(xì)胞的染色鑒定。通過PCR、瓊脂糖電泳、膠回收純化、與載體連接、感受態(tài)細(xì)菌轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、雙酶切鑒定等一系列步驟構(gòu)建轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒。使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒將所構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入關(guān)節(jié)細(xì)胞,G418篩選出陽性克隆。使用熒光定量PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測ASIC1a的mRNA和蛋白的相對表達(dá)量,以鑒定模型建立的成功與否,然后進(jìn)行電生理檢測及細(xì)胞分泌膠原量的檢測,在細(xì)胞代謝水平觀察酸敏

3、感通道的作用。
　　結(jié)果:1、通過對大鼠腦組織RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄,獲得ASIC1a基因,并與載體連接,通過大腸桿菌培養(yǎng),獲得足夠多的實驗用轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定包含目的基因,且酶切條帶準(zhǔn)確清晰。
　　2、Lipofectamine2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,獲得穩(wěn)定陽性克隆細(xì)胞,通過對ASIC1amRNA及其蛋白相對表達(dá)量檢測,表明轉(zhuǎn)染后細(xì)胞無論是mRNA或者蛋白量表達(dá)都相對上升。
　　3、通過激光共聚焦檢測Ca2+內(nèi)流,發(fā)現(xiàn)