酸敏感離子通道在酸誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡中的作用及其線粒體途徑機(jī)制研究.pdf

1、背景:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種不明病因的臨床綜合征,以慢性多關(guān)節(jié)炎癥為主要表現(xiàn),由于炎癥導(dǎo)致關(guān)節(jié)局部組織酸化,關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑液pH顯著下降。酸敏感離子通道(Acid-sensing ion channels,ASICs)是一類配體門控性離子通道,屬上皮鈉通道(EnaC)/退化因子基因(DEG)通道家族中的一個(gè)成員,能被細(xì)胞外pH下降或H+濃度上升激活。本課題組前期研究證實(shí)在佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuv

2、ant Arthritis,AA)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞上有ASICs的表達(dá),并參與病理情況下的關(guān)節(jié)軟骨代謝過程。
　　目的:本研究以體外培養(yǎng)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用不同程度的胞外酸化刺激大鼠軟骨細(xì)胞凋亡,觀察ASICs阻斷劑阿米洛利(Amiloride)對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞凋亡的影響,以探討ASICs在大鼠軟骨細(xì)胞凋亡過程中的作用及其可能的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.采用Ⅱ型膠原酶消化法分離大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,將細(xì)胞

3、分為四組分別在pH為7.4、6.5、6.0、5.5的培養(yǎng)基孵育,建立關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡體外模型,MTT法檢測(cè)不同程度酸化刺激對(duì)軟骨細(xì)胞生存率的影響,Hoechst染色法和Annexin V/PI雙標(biāo)記法分別觀察軟骨細(xì)胞凋亡形態(tài)和凋亡率的變化。
　　2.將軟骨細(xì)胞分為pH7.4環(huán)境下培養(yǎng)的正常組,pH6.0的酸化組,以及經(jīng)不同濃度Amiloride(50,100,or200μM)處理的酸化組,MTT法檢測(cè)不同組別軟骨細(xì)胞的生存率變化,

4、吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)染色法和Annexin V/PI雙標(biāo)記法分別觀察軟骨細(xì)胞凋亡形態(tài)和凋亡率的變化,羅丹明123(Rhodamine123,Rh123)染色在熒光顯微鏡下檢測(cè)軟骨細(xì)胞線粒體膜電位變化,RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞Bcl-2家族凋亡基因mRNA的表達(dá),比色法、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)Caspase-3/9活性和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.胞外酸化對(duì)體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞增殖的抑制作用
　　pH5.5和pH

5、6.0胞外酸化刺激均能明顯抑制體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞增殖,結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)的細(xì)胞凋亡率(15.94％、22.18%),酸化組細(xì)胞減少可能是由于酸中毒引起軟骨細(xì)胞凋亡造成的,且凋亡率與酸性程度相關(guān),由此可以推測(cè)酸中毒誘導(dǎo)凋亡的能力與酸中毒的程度有關(guān)。
　　2.酸敏感離子通道阻斷劑(Amiloride)對(duì)胞外酸化關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響
　　MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Amiloride各劑量組軟骨細(xì)胞生存率明顯高于酸化模型組;AO/EB染色發(fā)現(xiàn)

6、酸化模型組早期凋亡細(xì)胞增多,表現(xiàn)為細(xì)胞核被AO染色呈黃綠色熒光,晚期凋亡細(xì)胞亦增多表現(xiàn)為被EB染色呈桔紅色;而Amiloride處理組凋亡細(xì)胞明顯減少;Annexin-V聯(lián)合PI雙標(biāo)記法行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示Amiloride各劑量組軟骨細(xì)胞凋亡率明顯低于酸化模型組;Rh123染色結(jié)果顯示Amiloride各劑量組軟骨細(xì)胞線粒體膜電位明顯高于酸化模型組。
　　3.酸敏感離子通道阻斷劑 Amiloride對(duì)胞外酸化關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡

7、線粒體途徑有關(guān)凋亡基因和蛋白表達(dá)的影響
　　RT-PCR結(jié)果顯示Amiloride各劑量組軟骨細(xì)胞Bcl-2和Bax凋亡基因表達(dá)與酸化模型組差異具有顯著性;分光光度法檢測(cè)結(jié)果顯示Amiloride組軟骨細(xì)胞Caspase-3/9活性明顯低于酸化模型組;免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)果顯示Amiloride組軟骨細(xì)胞Caspase-3/9、Cytochrome C蛋白的表達(dá)與酸化模型組差異具有顯著性。
　　結(jié)論:
　　1.胞外酸化環(huán)境

8、下能明顯抑制體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞增殖、促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡,并隨著酸化的程度增加而加劇。
　　2.酸敏感離子通道阻斷劑Amiloride對(duì)于經(jīng)胞外酸化處理的體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡有抑制作用。
　　3.利用Amiloride阻斷ASICs對(duì)酸誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡有抑制作用,其可能的機(jī)制是通過阻斷ASICs,抑制Ca2+超載,保護(hù)軟骨細(xì)胞線粒體功能,調(diào)節(jié)Bcl-2家簇凋亡基因的表達(dá),控制Cyt-c的釋放和Caspase凋亡執(zhí)行蛋白的