酸敏感離子通道在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞中的表達和部分功能研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病，其主要病理特點是滑膜細胞增生，襯里層增厚，炎細胞浸潤，以及軟骨和骨組織的破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙。關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的破壞是致殘的根本原因，積極尋找導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞及骨組織病理生理改變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是防治該病的重點。 軟骨細胞本身的代謝對關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)(extracellar matrix，ECM)合成以及修復(fù)中起關(guān)鍵作用。組織酸化影響

2、關(guān)節(jié)軟骨細胞生長代謝，細胞外pH降低，可以激活與關(guān)節(jié)軟骨破壞相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶。但軟骨細胞是通過何種途徑來感受周圍環(huán)境pH的變化呢?研究表明，對于胞外pH的變化，細胞可以通過酸敏感離子通道(acid sensing ion channels，ASICs)途徑去感受胞外的pH改變。ASICs是一類由胞外酸化所激活的陽離子通道，近年來對.ASICs的研究發(fā)展非常迅速，因其具有廣泛的生物學(xué)功能和重要的病理學(xué)意義而備受關(guān)注。研究表明ASICs

3、在腦缺血、癲癇、腫瘤等伴有局部組織酸化的病理過程中發(fā)揮重要作用。RA由于炎癥導(dǎo)致關(guān)節(jié)局部組織酸化與腦缺血等導(dǎo)致的酸中毒具有相似的病理特點，那么，關(guān)節(jié)軟骨細胞是否存在ASICs?ASICs是否在RA關(guān)節(jié)軟骨破壞過程中發(fā)揮作用?組織酸化是炎癥病理下常見的現(xiàn)象，但對ASICs是否參與由組織酸化誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨損傷的病理生理過程，以及抑制或阻斷ASICs對炎癥損傷的關(guān)節(jié)軟骨是否有保護作用尚不清楚。為進一步探討ASICs在RA關(guān)節(jié)軟骨細胞中的作用。本

4、實驗以弗氏完全佐劑(Complete Freund's Adjuvant，CFA)誘導(dǎo)佐劑性關(guān)節(jié)炎 (adjuvant-inducedarthritis,AA)大鼠模型為研究對象，研究AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞中ASICs的表達與部分功能。 具體研究內(nèi)容包括以下四個部分： 1.大鼠關(guān)節(jié)軟骨ASICs的表達利用RT-PCR.和Western blot檢測ASICs在大鼠關(guān)節(jié)軟骨的表達。 結(jié)果:顯示大鼠關(guān)節(jié)軟骨存在AS

5、IC1a、ASIC2a和ASIC3mRNA及其蛋白的表達。半定量分析表明ASIClamRNA在大鼠關(guān)節(jié)軟骨的表達水平高于其它亞基。提示關(guān)節(jié)軟骨細胞存在ASICs，可能參與關(guān)節(jié)軟骨細胞的代謝過程。 2.AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨ASICs的表達大鼠右側(cè)后足跖皮內(nèi)注射CFA，誘導(dǎo)AA大鼠模型。用實時熒光定量PCR和Western blot方法檢測ASICs在AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨的表達。經(jīng)半定量分析，AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨中表達高水平的ASIC1a、AS

6、IC2a和ASIC3mRNA，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Western blot檢測顯示蛋白表達的變化與mRNA變化一致。 結(jié)果:提示AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨中ASICs的表達增多，參與病理情況下關(guān)節(jié)軟骨的代謝過程。 3.常用RA藥物對AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞ASICs的影響及作用48只大鼠，隨機分成正常組，AA模型組，阿司匹林(50 mg.kg-1)組，地塞米松(0.2 mg.kg-1)組，雷公藤多苷(50

7、 mg.kg-1)組和左旋咪唑(10 mg.kg-1)組。CFA致炎后d10起，AA大鼠出現(xiàn)繼發(fā)性炎癥，此時地塞米松組采用腹腔注射，其它用藥組分別灌胃給藥，正常組與模型組灌等容量的無菌注射用水，連續(xù)7d。實時熒光定量PCR和Western blot分析顯示阿司匹林能顯著抑制AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞ASICs mRNA和蛋白的表達(P<0.01)，其它用藥組對ASICs無明顯抑制作用，與模型組比較，無明顯差異(P>0.05)。各用藥組能明顯升

8、高AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)(ECM)成分II型膠原和aggrcan表達量，其中阿司匹林作用最顯著。 以上結(jié)果提示：抑制關(guān)節(jié)軟骨細胞ASICs的表達對關(guān)節(jié)軟骨具有保護作用，ASICs可能參與RA關(guān)節(jié)軟骨破壞。 　　4.ASICs阻斷劑amilofide對AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨損傷的影響40只大鼠，隨機分成正常組，AA模型組，amilofide(5 mg.kg-1)組，阿司匹林(50 mg.kg-1)組+amilofide(5 mg.

9、kg-1)組，阿司匹林(50 mg.kg-1)組。足容積法測量繼發(fā)側(cè)足腫脹度；病理組織學(xué)檢查結(jié)果顯示各用藥組關(guān)節(jié)軟骨損傷明顯改善；實時熒光定量PCR觀察.ASICs阻斷劑amilofide能抑制AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞ASICsmRNA的表達，其中阿司匹林合并amilofide組抑制最為顯著；免疫組化和alcim藍染色分別檢測ECM II型膠原和蛋白多糖的變化，結(jié)果:顯示各用藥組均明顯升高ECMII型膠原和蛋白多糖蛋的表達，其中阿司匹林合并

10、amilofide組作用最為顯著(P<0.01)。 通過離體細胞實驗，用激光共聚焦顯微鏡(Fura-3/AM)檢測細胞Ca2+濃度的方法，分析胞外不同濃度pH值和阻斷劑amilofide對關(guān)節(jié)軟骨細胞內(nèi)鈣離子濃度([ca2+]i)的影響結(jié)果:表明細胞外pH(6.5，pH6.5)可使關(guān)節(jié)軟骨細胞內(nèi)Ca2+水平短暫性升高，amilofide能明顯抑制pIt6.5誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨胞內(nèi)Ca2+水平。 以上結(jié)果提示：ASICs阻斷