沉默酸敏感離子通道1a對(duì)胞外酸化誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬的影響及其可能機(jī)制.pdf

1、酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)是一類(lèi)廣泛存在于細(xì)胞膜上的陽(yáng)離子通道，H+是最早發(fā)現(xiàn)的ASICs通道激動(dòng)劑，開(kāi)放的通道對(duì)Na+、Ca2+具有可通透性，參與細(xì)胞病理生理功能的改變。自噬(Autophagy)是一種依賴于溶酶體的細(xì)胞自我降解過(guò)程，具有多種生理病理功能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存在ASICs表達(dá)，胞外酸化刺激軟骨細(xì)胞，細(xì)胞自噬水平升高，細(xì)胞凋亡增加，但具體機(jī)制尚不明確

2、。本研究選用大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為研究對(duì)象，胞外酸化刺激軟骨細(xì)胞為體外模型，采用小分子干擾RNA(siRNA)技術(shù)沉默ASIC1a基因表達(dá)，探討ASIC1a對(duì)胞外酸化誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬的影響及其可能機(jī)制。
　　目的：本研究旨在觀察 ASIC1a對(duì)胞外酸化誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬活化的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。
　　內(nèi)容：
　　1.觀察不同的胞外酸化刺激條件下，大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬水平變化；
　　2.利用小

3、分子干擾RNA(siRNA)技術(shù)建立體外ASIC1a的表達(dá)沉默模型并驗(yàn)證其沉默效率；
　　3.觀察沉默或阻滯ASIC1a后，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬水平的變化；
　　4.探討ASIC1a參與胞外酸化誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬活化的機(jī)制；
　　方法：
　　1.不同胞外酸化條件(pH7.4、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0)/(pH6.0刺激15min、30min、1h、2h、3h、4h、5h)，作用于大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，通過(guò)

4、 Western-blot法檢測(cè)自噬蛋白LC3Ⅱ表達(dá)。
　　2.通過(guò)合成特異性熒光短鏈ASIC1a siRNA-FAM建立體外ASIC1a表達(dá)沉默模型，采用熒光倒置顯微鏡、Western-Blot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-RT-PCR)法檢測(cè)ASIC1a沉默效率和對(duì)ASIC1a mRNA和蛋白表達(dá)的影響；
　　3.選擇大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，設(shè)正常組、pH6.0酸化模型組、PcTx1組（100ng/mL）、特異性ASIC

5、1a siRNA沉默組、ASIC1a siRNA沉默陰性對(duì)照組，激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)[Ca2+]i水平；吖啶橙染色(Arcidine Orange，AO)觀察軟骨細(xì)胞酸性小體形成情況；實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western-Blot法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)基因LC3Ⅱ、Beclin1和ULK1含量；
　　4.選擇大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，設(shè)正常組、pH6.0酸化模型組、BAPTA-AM組、特異性ASIC1a siRNA沉默組、A

6、SIC1a siRNA沉默陰性對(duì)照組、BAPTA-AM+特異性ASIC1a siRNA沉默組，GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染觀察細(xì)胞內(nèi)LC3水平；實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western-Blot法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)基因?LC3Ⅱ、Beclin1和ULK1含量；
　　5.關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞胞外酸化刺激，采用Western-blot法檢測(cè)各組細(xì)胞 CaMKKβ、AMPK、mTOR的磷酸化水平；
　　6.胞外酸化刺激大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，設(shè)正常組

7、、pH6.0酸化模型組、3-MA自噬抑制劑組、特異性ASIC1a siRNA沉默組、ASIC1a siRNA沉默陰性對(duì)照組、3-MA+特異性ASIC1a siRNA沉默組，Hoechst33342染色分析細(xì)胞凋亡情況；流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因?Bax和Bcl-2的含量。
　　結(jié)果：
　　1.胞外酸化刺激大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，自噬標(biāo)志性蛋白 LC3Ⅱ呈時(shí)間和pH依賴性增加，且在pH6

8、.0，3h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大水平；
　　2.化學(xué)合成的特異性ASIC1a siRNA可成功轉(zhuǎn)染入大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后，軟骨細(xì)胞ASIC1a mRNA和蛋白水平顯著下調(diào)；
　　3.采用ASIC1a阻滯劑PcTX1和ASIC1a siRNA可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度降低，并且可以抑制胞外酸化誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞自噬活化，表現(xiàn)為：LC3Ⅱ、Beclin1和ULK1表達(dá)量顯著下調(diào)，AO染色結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)酸性自噬溶酶體數(shù)目減少；4．

9、ASIC1a siRNA和BAPTA-AM組中胞外酸化誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬活化減少，表現(xiàn)為：LC3Ⅱ、Beclin1和ULK1的水平顯著下調(diào)，細(xì)胞內(nèi)GFP-LC3數(shù)目減少。
　　5.沉默ASIC1a組或BAPTA-AM組可抑制胞外酸化誘導(dǎo)的CaMKKβ及AMPK磷酸化水平升高和mTOR磷酸化水平降低。
　　6.沉默ASIC1a或3-MA自噬抑制組，Bax mRNA表達(dá)量下降，Bcl-2 mRNA表達(dá)量升高，軟骨細(xì)胞凋亡