清心飲對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響及其部分機(jī)制研究.pdf

1、目的：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種臨床常見的慢性自身免疫性炎性疾病，以累及周圍關(guān)節(jié)為主，亦可侵袋心血管等關(guān)節(jié)外臟器組織。近年來，RA心血管并發(fā)癥的發(fā)生率與死亡率呈不斷上升的趨勢(shì)。RA的心血管損害以動(dòng)脈粥樣硬化為主，而血管內(nèi)皮功能障礙被認(rèn)為是啟動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的第一步，與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為此，進(jìn)一步探討RA血管內(nèi)皮功能障礙及其發(fā)生機(jī)制，保護(hù)內(nèi)皮功能，成為改善RA預(yù)后的主要研究目標(biāo)之

2、一，具有重要的臨床意義。本課題擬通過建立佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant-induced arthritis，AA)大鼠模型，研究清心飲對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠離體贏管內(nèi)皮依賴性舒張功能的作用，并分忻其對(duì)模型大鼠血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-iβ（interleukin-1β，IL-1β）、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory facto

3、r, MIF)、脂聯(lián)素(adiponectin，APN)水平，血漿N末端-前腦利鈉肽(NT-proBNP)、內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)水平，以及胸主動(dòng)脈內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)與MIF蛋白表達(dá)的影響，探討由清熱解毒類抗蛇毒中藥組成的清心飲對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療RA動(dòng)脈粥樣硬化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：選擇體重150-180g（喂食適應(yīng)性飼料3天后）的Wistar大鼠

4、，雌雄各半。測(cè)量雙側(cè)足爪厚度及容積后，于右后足跖底部常規(guī)消毒，皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑（0.1ml/只）建立AA大鼠模型。其中8只大鼠用相同方法注入等量生理鹽水。每周測(cè)量關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis Index，Al);造模后第19天將出現(xiàn)二次反應(yīng)且AI值大于5的大鼠隨機(jī)分成模型組、甲氨蝶呤組(MTX)、清心飲組(QXY)、甲氨蝶呤聯(lián)合清心飲組(MTX+QXY)，每組8只，注射生理鹽水大鼠為空白對(duì)照組。當(dāng)日測(cè)量大鼠體重，用自制容積測(cè)量?jī)x測(cè)

5、量各組大鼠足爪容積，游標(biāo)卡尺測(cè)量各組大鼠足爪厚度。各治療組連續(xù)灌胃給藥21天（模型組灌胃給予等量生理鹽水）；于給藥結(jié)束后第2天測(cè)量各組大鼠體重、足爪厚度及容積，4％水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分別留取血清、血漿，-70℃低溫冰箱保存?zhèn)錂z。取血后立即打開胸腔，取出胸主動(dòng)脈，置于通入95％氧氣和5％二氧化碳、PH為7.4±0.05的克氏液中，分離并去除血管鬧圍脂肪及結(jié)締組織，保留血管內(nèi)皮，截取3-4mm的血管環(huán)，主動(dòng)脈環(huán)浴皿法檢測(cè)內(nèi)皮依賴性

6、舒張功能；剩余部分主動(dòng)脈固定、脫水、包埋進(jìn)行HE染色，免疫組織化學(xué)法測(cè)定胸主動(dòng)脈ET-1及MIF表達(dá)，并進(jìn)行半定量分析。采用放射免疫法測(cè)定血清TNF-α、IL-1β及血漿ET-1水平；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定血漿NT-proBNP、血清脂聯(lián)素及血清MIF含量。
　　 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS for windows13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(?)±s）表示，自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后仍為非正

7、態(tài)分布數(shù)據(jù)者用中位數(shù)(median)表示。各組間兩兩比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)或非參數(shù)檢驗(yàn)(Nonparametric test)。方差分析前進(jìn)行力差齊性檢驗(yàn)，采用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.QXY對(duì)AA大鼠一般情況的影響
　　 與模型組相比，甲氨蝶呤組(MTX)、清心飲組(QXY)、甲氨蝶呤聯(lián)合

8、清心飲組(MTX+QXY)一般情況均有所改善。造模前各組大鼠體重(g)分別為空白組165.25±8.40、模型組164.75±10.55、QXY組164.50±7.05、MTX組166.13±6.24、聯(lián)合組166.13±8.46；各組間體重相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。造模后第19天，各組大鼠體重(g)分別為空白組215.25±14.73、模型組190.50±9.21、QXY組194.50±16.43、MTX組193.00±13.

9、40、聯(lián)合組194.88±15.91;模型組、MTX組、QXY組、聯(lián)合組大鼠體重明顯低于空白對(duì)照組，差異具有顯著性（P＜0.01）；但模型組、MTX組、QXY組、聯(lián)合組組間體重比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。給藥3周后，各組大鼠體重(g)分別為空白組277.88±19.78、模型組217.38±14.48、QXY組228.25±24.31、MTX組234.63±12.59、聯(lián)合組247.38±16.47;模型組、MTX組、QXY組

10、、聯(lián)合組的大鼠體重低于空白對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)。模型組、QXY組和MTX組組間相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；但聯(lián)合組體重明顯高于模型組，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 灌胃前后體重增加量相比較，MTX組、QXY組、模型組體重增加值低于空白對(duì)照組（P＜0.05、P＜0.01）；模型組體重增加低于MTX組、聯(lián)合組(P＜0.05、P＜0.01)；但QXY組體重增加與模型組、MTX組相比，聯(lián)合組體重增加與正

11、常組相比，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 2.QXY對(duì)AA大鼠足爪腫脹的抑制作用及關(guān)節(jié)炎指數(shù)的改善作用
　　 灌胃完畢后造模側(cè)（右足）平均腫脹率(％)分別為：模型組89.44±6.11、QXY組80.62±5.96、MTX組67.38±11.49、聯(lián)合組55.58±9.14;MTX組、QXY組、聯(lián)合組右足腫脹率明顯低于模型組（P＜0.05、P＜0.01）；與MTX組、QXY組相比，聯(lián)合組對(duì)造模側(cè)足爪腫脹的抑制率較

12、好，差異具有顯著性（P＜0.01）；MTX組與QXY組相比，MTX右足腫脹率低于QXY組，差異具有顯著性（P＜0.01）。灌胃完畢后非造模側(cè)（左足）平均腫脹度(％)分別為：模型組70.09±5.11、QXY組59.02±4.90、MTX組51.55±10.14、聯(lián)合組40.58±5.25;MTX組、QXY組、聯(lián)合組左足腫脹率明顯低于模型組，差異具有顯著性（P＜0.01）。與MTX組、QXY組相比，聯(lián)合組對(duì)非造模側(cè)足爪腫脹的抑制率較好，差

13、異具有顯著性（P＜0.01）。MTX組與QXY組相比，MTX左足腫脹率低于QXY組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，除空白對(duì)照組，各組大鼠關(guān)節(jié)紅腫逐漸加重，關(guān)節(jié)炎指數(shù)逐漸增高。給藥前各組大鼠關(guān)節(jié)指數(shù)分別為模型組10.63±2.07、QXY組11.75±3.85、MTX組10.38±2.92、聯(lián)合組11.88±3.0'；各組間相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。灌胃3周后，各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)分別為模型

14、組10.75±1.58、QXY組8.88±2.47、MTX組7.38±3.16、聯(lián)合組6.50±2.51;MTX組、聯(lián)合組關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯低于模型組（P＜0.05、P＜0.01）；QXY組關(guān)節(jié)炎指數(shù)高于MTX組（P＜0.05）；而QXY組關(guān)節(jié)炎指數(shù)雖低于模型組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 3.QXY對(duì)AA大鼠離體胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響
　　 各組大鼠對(duì)不同濃度（10-8mol/L、10-7mol/

15、L、10-6mol/L、10-5mol/L）乙酰膽堿引起的內(nèi)皮依賴性舒張作用的反應(yīng)如下：模型組、MTX組、QXY組、聯(lián)合組舒張率(％)明顯低于空白對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)；MTX組、QXY組舒張率明顯高于模型組，差異具有顯著性(P＜0.01)；MTX組、QXY組低于聯(lián)合組，差異具有顯著性(P＜0.01)；MTX組與QXY組相比，MTX組舒張率顯著高于QXY組(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 4.QXY對(duì)AA大

16、鼠血清TNF-α、IL-iβ、MIF、APN的影響
　　 4.1血清TNF-α、IL-iβ水平比較
　　 各組大鼠血清TNF-α含量(ng/ml)分別為空白組1.043±0.117、模型組3.307±0.203、QXY組2.686±0.122、MTX組2.444±0.140、聯(lián)合組1.183±0.089;模型組、MTX組、QXY組血清TNF-α水平明顯高于空白對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)；聯(lián)合組與空白對(duì)照組相比

17、，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；MTX組、QXY組、聯(lián)合組明顯高于模型組，差異具有顯著性（P＜0.01）；MTX組、QXY組大鼠血清TNF-α平均含量低于聯(lián)合組，差異具有顯著性(P＜0.01)；MTX組與QXY組相比，MTX組大鼠血清TNF-α平均含量低于QXY組，差異具有顯著性（P＜0.01）。
　　 結(jié)論：
　　 1.AA大鼠存在血管內(nèi)皮損傷和早期動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)因素。
　　 2.MIF及NT-proBNP

18、可能參與AA大鼠血管內(nèi)皮損傷的病理過程；而APN則是血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)性因子之一；三者均可作為AA大鼠早期動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)測(cè)因素。
　　 3.清心飲可明顯抑制AA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)，降低血消炎性細(xì)胞因子TNF-α、1L-1β水平；清心飲與MTX配伍則可顯著增強(qiáng)上述抗炎作用。
　　 4.清心飲對(duì)AA大鼠血管內(nèi)皮損傷具有顯著保護(hù)效應(yīng)，其部分作用機(jī)制包括：下調(diào)血液和胸主動(dòng)脈ET-1、MIF表達(dá)；降低血清TNF-α、IL-1β和血漿