骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎免疫作用機(jī)制的研究.pdf

1、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheurmatoid arthritis，RA)是一種慢性進(jìn)行性的自身免疫性疾病，后期出現(xiàn)骨功能障礙。傳統(tǒng)治療方法以非甾體類(lèi)抗炎藥及免疫抑制藥物治療為主，但并不能改變疾病的進(jìn)展，不能防止關(guān)節(jié)的破壞。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Marrow mesenchymal stem cell s，MSCs)具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用，并且已經(jīng)在多種自身免疫性疾病的動(dòng)物模型中應(yīng)用，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。本研究采用免疫病理改變與RA

2、類(lèi)似的佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvantarthritis，AA)大鼠模型，觀察MSCs治療的效果，并探討其發(fā)揮治療作用的免疫機(jī)制，為今后臨床使用MSCs治療RA提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。
　　目的:探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和培養(yǎng)上清液對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎干預(yù)、治療后的療效及免疫作用改變。
　　方法:取SD(Sprague-Dawley rat)大鼠的股骨和脛骨骨髓，經(jīng)貼壁篩選法體外分離、培養(yǎng)并純化MSCs。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD71、CD29、

3、CD34和CD45表達(dá)并進(jìn)行鑒定。設(shè)模型組（A組）、正常組（B組）、培養(yǎng)液對(duì)照組（C組）、MSCs治療組（D組）、MSCs上清液治療組（E組）、MSCs干預(yù)組（F組）、MSCs上清液干預(yù)組（G組）。實(shí)驗(yàn)各個(gè)階段，測(cè)定每組動(dòng)物體重及足趾體積。除B組外，其他各組用弗氏完全佐劑(Freund' scomplete adjuvant，CFA)造模。在造模同時(shí)，F(xiàn)、G組使用MSCs和培養(yǎng)上清液進(jìn)行治療。觀察飼養(yǎng)3w后，D組及E組使用MSCs和上清

4、液治療。C組給予L-DMEM液。上述各組動(dòng)物飼養(yǎng)觀察至第7w，測(cè)量各組大鼠的足爪腫脹程度，足爪關(guān)節(jié)病理及X線(xiàn)骨關(guān)節(jié)改變，免疫器官脾臟和胸腺大體形態(tài)、重量指數(shù)。用免疫組化法標(biāo)記脾臟、胸腺中CD3、CD4和CD8細(xì)胞，用Biomias圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，觀察治療前后變化。
　　結(jié)果:應(yīng)用貼壁篩選的方法成功分離、培養(yǎng)以及擴(kuò)增了MSCs，經(jīng)反復(fù)傳代純化的MSCs用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD71、CD29呈陽(yáng)性表達(dá)而CD34、CD45

5、呈陰性表達(dá)，符合MSCs的生物學(xué)特征。AA大鼠注射弗氏完全佐劑3w后，足爪腫脹，后肢足趾關(guān)節(jié)X線(xiàn)片可見(jiàn)周?chē)浗M織影增厚，骨性關(guān)節(jié)面模糊不光滑呈鋸齒狀，滑膜面破壞。MSCs和培養(yǎng)上清液治療后至實(shí)驗(yàn)第7w，原發(fā)性關(guān)節(jié)腫脹和繼發(fā)性關(guān)節(jié)腫脹都有明顯的被抑制，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。周?chē)浗M織影增厚減輕，骨性關(guān)節(jié)面光滑，滑膜細(xì)胞少量增生，脾臟胸腺重量指數(shù)不同程度的降低。免疫組化檢查，從灰度值分析上可見(jiàn)，胸腺中CD3灰度值在模型

6、組為(56.97±1.59)，而MSCs治療后為(82.26±3.83);脾臟中CD3灰度值在模型組為(63.35±2.54)，而MSCs治療后為(86.01±0.66)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示MSCs降低了AA大鼠胸腺、脾臟中增長(zhǎng)的CD3+細(xì)胞數(shù)量，胸腺中CD4灰度值在模型組為(75.45±5.78)，而MSCs治療后為(86.90±4.23);脾臟中CD4灰度值在模型組為(74.45±4.73)，而MSCs治療后為（85.3

7、8±3.13），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示MSCs降低了AA大鼠胸腺、脾臟中增加的CD4+細(xì)胞數(shù)量。胸腺中CD8灰度值在模型組為(93.94±3.58)，而MSCs治療后為(75.33±3.29);脾臟中CD8灰度值在模型組為(80.61±4.61)，而MSCs治療后為(64.32±3.32)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示MSCs增加了AA大鼠胸腺、脾臟中減少的CD8+細(xì)胞數(shù)量。在造膜的同時(shí)使用MSCs和培養(yǎng)上清液干預(yù)后，動(dòng)物生長(zhǎng)