骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎機(jī)制和相關(guān)研究.pdf

1、本研究分為三部分。本文的第一部分主要是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者免疫機(jī)制的體外研究。體外實(shí)驗(yàn)中我們采集了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的骨髓標(biāo)本，分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增了RA患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察了原代和傳代的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，體外增殖能力、集落形成狀況、細(xì)胞表面標(biāo)記、以及電鏡超微結(jié)構(gòu)等一般生物學(xué)特性；另外在體外實(shí)驗(yàn)中我們將MSCs與RA患者T,B淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察了不同比例狀態(tài)下MSCs共培養(yǎng)對RA患者T,B淋巴

2、細(xì)胞的增殖，活化和功能成熟以及對其免疫調(diào)節(jié)和產(chǎn)生細(xì)胞因子等的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，來自RA患者的MSCs呈典型的成纖維樣細(xì)胞形態(tài)、表型鑒定CD45陰性，SH2(CD105)、CD71、CD44均陽性，其增殖能力和CFU-F集落形成狀況、以及電鏡超微結(jié)構(gòu)等方面都與來源于健康對照組的MSCs無明顯差異；MSCs與RA患者T、B淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，正常骨髓來源的MSCsX寸PHA和SAC刺激的RA患者T、B淋巴細(xì)胞的增殖均有抑制作用，并且這

3、種抑制作用與BM-MSC的劑量呈依賴性；MSCs可以阻止T細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞增殖周期；MSCs可以明顯抑制活化的RA患者T淋巴細(xì)胞凋亡；但是MSC能促進(jìn)B細(xì)胞功能成熟，分泌IgG增加。結(jié)果提示MSCs在多個環(huán)節(jié)對T,B淋巴細(xì)胞有免疫調(diào)節(jié)作用，并且上述的免疫調(diào)節(jié)作用不受MHC的限制。在MSCs對細(xì)胞因子產(chǎn)生影響的研究中，我們分別用ELASA方法檢測了MSCs與RA患者淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中IL-1、TNF-α、TGF-β1的含量，同時用RT-P

4、CR檢測了細(xì)胞內(nèi)IL-1、TNF-α、TGF-β1的基因表達(dá)。我們看到MSCs與患者淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)時可以影響IL-1、TNF-α及TGF-β1等細(xì)胞因子的產(chǎn)生和表達(dá)。 在第二部分的研究中，我們利用動物實(shí)驗(yàn)主要探討了在機(jī)體內(nèi)環(huán)境下，MSCs對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型的免疫紊亂調(diào)節(jié)和關(guān)節(jié)滑膜、軟骨損傷的修復(fù)效應(yīng)，以及MSCs治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的可行性、作用機(jī)制和治療途徑。我們將體外培養(yǎng)擴(kuò)增后的MSCs經(jīng)Brdu標(biāo)記后從實(shí)驗(yàn)動物尾靜脈注入，

5、對模型大鼠進(jìn)行異基因MSCs移植治療。觀察了治療前后實(shí)驗(yàn)動物一般狀況和關(guān)節(jié)腫脹的變化，同時從整體角度，動態(tài)觀察了MSCs治療前后實(shí)驗(yàn)動物外周血象變化；血清中IL-1、TNF-α及TGF-β1等細(xì)胞因子的變化，從局部角度觀察了MSCs在受損關(guān)節(jié)局部滑膜、軟骨區(qū)的趨化和聚集，以及對受損關(guān)節(jié)局部滑膜、軟骨破壞的保護(hù)和修復(fù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示異基因MSCs移植治療方法是安全的，并可有效改善RA實(shí)驗(yàn)動物的關(guān)節(jié)腫脹癥狀。經(jīng)局部關(guān)節(jié)滑膜、軟骨組織病理切

6、片，BrdU和OPG(骨保護(hù)素)免疫組化結(jié)果顯示，在受損關(guān)節(jié)滑膜、血管內(nèi)膜及軟骨中均可見大量棕黃色顆粒的BrdU陽性細(xì)胞，而正常關(guān)節(jié)滑膜處棕黃色顆粒出現(xiàn)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)相對較少，同時MSC治療組關(guān)節(jié)滑膜中OPG陽性率增加。說明經(jīng)外周靜脈輸入的MSCs可集中趨化到實(shí)驗(yàn)動物炎癥損傷部位，阻止局部組織損傷。并對模型鼠機(jī)體免疫紊亂狀態(tài)起調(diào)節(jié)作用。MSCs在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型移植治療有效的研究結(jié)果，為利用MSCs的免疫調(diào)節(jié)和損傷修復(fù)特性治療類